[发明专利]miR-124基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种miR‑124基因敲除小鼠动物模型，所述小鼠动物模型是被敲除了miR‑124‑1、miR‑124‑2、miR‑124‑3基因的小鼠。本发明使用Crispr‑cas9基因敲除技术，敲除了小鼠大脑中表达量最高的microRNA基因miR‑124。所获得的小鼠均表现出明显的自主活动降低、学习记忆力下降、可溶性β淀粉样蛋白增多等神经系统疾病状态。可以为神经系统疾病病理的研究，神经系统疾病药物的筛选提供简单、可靠、经济的动物模型。

主权项

1.一种miR‑124基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建针对miR‑124‑1、miR‑124‑2、miR‑124‑3基因的sgRNA；所述miR‑124‑1的sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述miR‑124‑2的sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述miR‑124‑3的sgRNA序列如SEQ ID NO.3所示；SEQ ID NO.1所示序列中：GATCACTAATACGACTCACTATAGG为T7启动子区域；CAAGGTCCGCTGTGAACA为靶点特异性序列；GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT为引导RNA骨架序列；SEQ ID NO.2所示序列中：GATCACTAATACGACTCACTATAGG为T7启动子区域；CAAGGTCCGCTGTGAACA为靶点特异性序列；GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT为引导RNA骨架序列；SEQ ID NO.3所示序列中：GATCACTAATACGACTCACTATAGG为T7启动子区域；CCCTCTGCGTGTTCACAG为靶点特异性序列；GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT为引导RNA骨架序列；(2)PMSG处理C57/BL6雌性小鼠，46小时后注射hCG，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射，将步骤(1)所述的sgRNA与Cas9核酸酶mRNA体外转录后，注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠；(3)提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序，鉴定是否为嵌合体；(4)待雄性Founder小鼠到7周龄，雌性小鼠到4周龄，可分别与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，小鼠出生20天后PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞；(5)将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠，即为小鼠动物模型。