[发明专利]一种脱除辣椒种子中蚕豆萎蔫病毒2号的方法

摘要

本发明涉及一种脱除辣椒种子中蚕豆萎蔫病毒2号的方法，属种子处理技术领域。具体通过以下步骤完成：（1）湿热处理，（2）药剂处理，（3）滤种，（4）漂洗，（5）烘干，（6）病毒检测。该方法克服了现有技术的不足，利用本发明提供的方法不仅提高了辣椒种子的发芽率及发芽势，而且对辣椒种子中蚕豆萎蔫病毒2号的脱除更为彻底，脱除率达到100%。另外本发明提供的一种可对脱毒效果进行评价的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，能够精确掌握脱毒种子中病毒的含量，从而在保证种子高品质的前提下，准确控制钝化病毒的技术指标，做到最大限度地抑制病毒活性。本发明提供的辣椒种子脱毒方法不受时间限制、环境的影响，可常年在实验室或基层单位使用，非常实用，可用于脱毒辣椒种子的规模化生产。

主权项

1.一种脱除辣椒种子中蚕豆萎蔫病毒2号的方法，其特征在于通过以下步骤实现：/n（1）湿热处理：将辣椒种子浸泡于5倍体积的沸水中，并迅速震荡冷却至40-45 ℃，滤干水溶液；/n（2）药剂处理：在滤干水溶液的辣椒种子中加入5倍体积的10%Na₃PO₄溶液，浸泡40min；/n（3）滤种：药剂处理结束后，过滤种子，滤去10%Na₃PO₄溶液；/n（4）漂洗：用无菌水清洗辣椒种子3-5次，滤干无菌水；/n（5）烘干：及时将步骤4中得到的种子放于网架上置于烘箱内，40 ℃处理72 h，防止种子发芽及霉变；/n（6）病毒检测：利用TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对步骤5获得的种子进行病毒检测，并根据PCR扩增曲线Ct值和标准曲线方程即可对辣椒种子中的蚕豆萎蔫病毒2号进行精确定量，计算脱毒率；/n所述的病毒检测中，提取辣椒种子总RNA：随机选取10粒脱毒处理的种子和10粒未脱毒处理的种子，各为1份，分别在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，抽提RNA产物加入DEPC-ddH₂O溶解，-70 ℃保存备用；/n所述的病毒检测中，cDNA的合成：以提取的待测辣椒种子总RNA为模板，反转录制备cDNA模板，反转录体系为20µL包括：RNA模板2µL，10mmol/L的dNTPs 2µL，10µmol/L的随机引物2µL，10×RT mix 2 µL，Quant Reverse Transcriptase 2µL，RNase-free ddH₂O 10µL；反应条件：37 ℃，60min；/n所述的病毒检测中，实时荧光定量PCR检测：以合成的cDNA为模板，利用BBWV2特异性引物对：BBWV2-F:5’-TCGTACTGAAGTCCATCTTAAAA-3’；BBWV2-R:5’-CGGAAAAAGGGAGTGTGATT-3’及TaqMan探针：BBWV2-Probe:5’-TET-AGGTAGCAAAATGAAATCA-BHQ1-3’进行实时荧光定量PCR检测；实时荧光定量PCR检测体系为20 µL：包括2×Master Mix（Probe）10µL，10µmol/L的上游引物BBWV2-F 0.6µL、10µmol/L的下游引物BBWV2-R 0.6µL，10µmol/L的TaqMan探针BBWV2-Probe 0.4µL，模板1µL，补足灭菌ddH₂O至20µL；荧光定量PCR检测反应程序为：50 ℃预处理2min；95 ℃预变性10min；95 ℃变性15s，58℃退火、延伸1min，循环40次；58 ℃收集荧光。/n