[发明专利]一种同时检测四种呼吸道病毒的RT‑PCR方法所用的四对上下游引物

摘要

一种同时检测四种呼吸道病毒的RT‑PCR方法所用的四对上下游引物，属于生物工程技术领域。本发明结合无锡地区常见呼吸道病毒的流行特性，为建立一种能同时检测甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、副流感病毒Ⅰ型（PIVⅠ）和副流感病毒Ⅲ型（PIVⅢ）四种呼吸道病毒的多重PCR方法，提供四对上下游引物。该方法可以在一个反应体系中检测多种病毒，简化了实验过程，缩短了实验时间，降低了实验成本，提高了检测效率。

主权项

一种同时检测四种呼吸道病毒的RT‑PCR方法所用的四对上下游引物，其特征在于：引物设计：分别设计针对FluA、FluB、PIVⅠ和PIVⅢ 基因组保守区的四对引物如下：PIVⅠ上游引物：5’‑CCGGTAATTT CTCATACCTA TG‑3’，PIVⅠ下游引物：5’‑CCTTGGAGCG GAGTTGTTAA G‑3’ ，产物大小：317bp；PIVⅢ上游引物：5’‑CTCGAGGTTG TCAGGATATA G‑3’，PIVⅢ下游引物：5’‑CTTTGGGAGT TGAACACAGT T‑3’ ，产物大小：189bp；FluA上游引物：5’‑TTCTAACCGA GGTCGAAACG‑3’，FluA下游引物：5’‑ACAAAGCGTC TACGCTGCAG‑3’ ，产物大小：230bp；FluB上游引物：5’‑GGGACATGAA CAACAAAGAT GC‑3’，FluB下游引物：5’‑TGTCAGCTAT TATGGAGCTG‑3’ ，产物大小：425bp；在设计的单一引物对病原的目标片段分别都能扩增出来，分别将四种引物的各对40µM的上下游引物按体积比1︰1 混合，再将引物FluA︰FluB︰PIVⅠ︰PIVⅢ按体积比1︰3︰2︰2混合，混合后的引物作为本发明的使用引物；提取呼吸道标本的总核酸DNA&RNA；PCR检测的反应体系为25µL，包括Enzyme Mix 1µL，5 X buffer 6µL，dNTP 1µL，混合后的引物4µL，待检模版5µL，水补充至25µL，待检模板为从呼吸道标本中提取的总核酸，Enzyme Mix、dNTP和5 X buffer为QIAGEN OneStep RT‑PCR Kit试剂盒提供；PCR检测的反应程序为：50℃ 30min；95℃ 15min；94℃ 变性30sec，50℃ 退火30sec，72℃ 延伸1min，35个循环；72℃ 10min。