[发明专利]一种兰州百合PR5基因定量检测试剂盒及其检测方法

摘要

一种兰州百合病程相关蛋白PR5基因定量检测的试剂盒及其检测方法，该试剂盒主要包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂、荧光定量PCR反应试剂以及阳性对照品和阴性对照品；特异性引物由兰州百合PR5基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成；阳性对照品为兰州百合PR5基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品；阴性对照品为DEPC水；本发明针对兰州百合PR5基因提供了一种快速、敏感、特异的定量检测试剂盒和检测方法，为兰州百合PR5基因的表达及检测诊断提供了技术支持。

主权项

一种兰州百合PR5基因定量检测试剂盒，包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂以及荧光定量PCR反应试剂，所述特异性引物由兰州百合PR5基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成，所述特异性引物的序列如下：兰州百合PR5基因上游引物P1：5’‑ CGGCTGAACTGAAGGTAG ‑3’兰州百合PR5基因下游引物P2：5’ ‑TAGAGGTGGCATCATCGTA ‑3’内参18S rRNA基因上游引物P3：5’‑ GGGGAAACTTACCAGGTCCA ‑3’内参18S rRNA基因下游引物P4：5’ ‑CAGACAAATCGCTCCACCAA ‑3’其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为兰州百合PR5基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品，所述阴性对照品为DEPC水；所述阳性对照品序列如下：兰州百合PR5基因标准品：cggctgaactgaaggtagtaatgtcaagtgagagcgttgcttgcaagagcgcttgtgatgcgtttggatcgcctgagtattgctgtaaaggagattatggcaattctaacatttgcaggccgaccgtgtactcagagttctttaaaaatgcttgcccgagggcgtacagttatgcttacgatgatgccacctcta；内参18S rRNA基因标准品：ggggaaacttaccaggtccagacatagtaaggattgacagactgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctg;其特征在于将上述阳性对照品序列构建到质粒载体中，测定阳性质粒浓度后换算为拷贝数，然后用双蒸水将上述阳性质粒进行10倍梯度稀释，以10倍系列稀释的阳性质粒溶液作为模板，应用上述特异性引物P1、P2及P3、P4分别进行荧光定量PCR扩增，根据拷贝数的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到PR5基因和18S rRNA基因的标准曲线；同时将待测样品提取总RNA后进行反转录RT反应,以合成的cDNAs为模板，应用上述特异性引物P1、P2及P3、P4在相同条件下进行荧光定量PCR扩增，测得待测样品cDNAs的Ct值后，对照标准曲线即可获得待测样品起始cDNAs中PR5基因和18S rRNA基因的精确拷贝数，再经过内参校正后最终获得待测样品PR5基因的标准拷贝数。