[发明专利]一种利用胡萝卜纯愈伤组织培养繁殖无菌香蕉穿孔线虫的方法

摘要

本发明公开了一种利用胡萝卜纯愈伤组织培养繁殖无菌香蕉穿孔线虫的方法。该方法是在无菌条件下，将香蕉穿孔线虫依次用过氧化氢溶液消毒和氧氟沙星溶液浸泡处理后，接种于无菌胡萝卜纯愈伤组织上，封口黑暗培养；所述无菌胡萝卜纯愈伤组织是在无菌条件下，将培育的胡萝卜纯愈伤组织切成小颗粒块，浸泡于含有氯霉素和万古霉素的溶液中消毒，再点种于植物组织培养基上，黑暗培养所得。本方法可稳定、高效、快速地培养繁殖大量无菌香蕉穿孔线虫，能够提供符合要求的充足无菌虫源，而且处理条件温和可控，对线虫生物活性和繁殖力影响小，使用操作更加安全，该方法具有很好的推广应用前景。

主权项

1.一种利用胡萝卜纯愈伤组织培养繁殖无菌香蕉穿孔线虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.香蕉穿孔线虫无菌处理/n无菌条件下，收集香蕉穿孔线虫，用无菌水洗涤后，用体积浓度5～8％的过氧化氢溶液进行消毒1～5min；再用无菌水洗涤线虫，再用0.1～0.3wt％氧氟沙星溶液浸泡线虫8～16h，最后用无菌水洗涤，得到无菌香蕉穿孔线虫；/nS2.制备无菌胡萝卜纯愈伤组织/nS21.无菌条件下，将胡萝卜去表皮并切成薄片放入灭菌培养容器中，20～30℃黑暗培养25～35d至长出愈伤组织；/nS22.然后将长出的纯愈伤组织切成小颗粒块，浸泡于含有氯霉素和万古霉素的溶液中消毒2～6h，再点种于植物组织培养基上，20～30℃黑暗培养35～45d至愈伤组织长至可以接种线虫的大小；所述含有氯霉素和万古霉素的溶液中，氯霉素的浓度为0.4～0.6wt％氯霉素，万古霉素的浓度为0.25～0.35wt％；所述植物组织培养基为含有1～3mg/L奈乙酸和0.1～0.3mg/L 6-苄基腺嘌呤的MS培养基；/nS23.无菌胡萝卜纯愈伤组织的继代培养：无菌条件下，将S22第一代培养的无菌胡萝卜纯愈伤组织再切成小颗粒块，并分别点种于植物组织培养基上黑暗培养，如此重复，完成无菌胡萝卜纯愈伤组织的继代培养；/nS3.无菌香蕉穿孔线虫培养繁殖/n无菌条件下，将步骤S1处理后的无菌香蕉穿孔线虫接种于步骤S2长好的无菌胡萝卜纯愈伤组织上，封口，22～28℃黑暗培养60～75d；/nS4.无菌香蕉穿孔线虫的继代培养/n收集S3第一代培养的无菌香蕉穿孔线虫，用无菌水或利福平溶液洗涤线虫，重复步骤S2和步骤S3的操作。/n