[发明专利]一种分子检测和鉴定甘蔗赤条病菌不同株系的试剂盒

摘要

本发明涉及一种分子检测和鉴定甘蔗赤条病菌Acidovorax avenae subsp.avenae（Aaa）不同株系试剂盒。本发明的试剂盒中至少包括外侧引物对16S‑F4/23S‑R4和内侧引物对ITS‑F1/ITS‑R1，试剂盒内还有PCR反应液I和II、限制性内切酶反应液、Ex Taq酶液、HindIII内切酶、EcoRI内切酶、阳性样品DNA、阴性样品DNA和无核酸酶无菌水。本发明集合了巢式PCR检测方法的高度灵敏性和限制性内切酶切条带长度多态性与唯一性等优点，为甘蔗赤条病菌检测和鉴定提供了一种简便、快速、准确的方法。采用本发明试剂盒提供的试剂，经检测可判定是甘蔗赤条病菌及其株系类型。

主权项

1.一种分子检测和鉴定甘蔗赤条病菌不同株系的试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂组成：（1）PCR反应液I：每个PCR反应液包括：10×PCR缓冲液2.5 µL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 µL、以及浓度为10 µmol/L的外侧引物16S‑F4和23S‑R4各1.0 µL，共6.5 µL，50个反应体系共计325 µL，‑20 ℃保存备用；所述外侧引物16S‑F4：5'‑CGTGAAGTCGGAATCGCTA‑3'；23S‑R4：5'‑TCGGAATCTCGGTTGATG‑3'；（2）PCR反应液II：每个PCR反应液包括：10×PCR缓冲液5.0 µL、2.5 mmol/L dNTPs 4.0 µL、以及浓度为10 µmol/L的内侧引物ITS‑F1和ITS‑R1各2.0 µL，共13.0 µL，50个反应体系共计650 µL，‑20 ℃保存备用；所述内侧引物ITS‑F1：5'‑AGACCCACCAAATCTTCCG‑3'；ITS‑R1：5'‑GACATCTCCGCTTTCTTTCAAG‑3'；（3）限制性内切酶缓冲液：每个酶切反应液包含10×酶切缓冲液2.0 µL，50个反应体系共计100 µL，‑20 ℃保存备用；（4）Ex Taq酶：每个PCR反应体系包括5 U/µL Ex Taq酶0.75 µL，50个反应体系共计37.5 µL，‑20 ℃保存备用；（5）HindIII内切酶：每个限制性内切酶反应体系包括15 U/µL HindIII内切酶1.0 µL，50个反应体系共计50 µL，‑20℃保存备用；（6）EcoRI内切酶：每个限制性内切酶反应体系包括15 U/µL EcoRI内切酶1.0 µL，50个反应体系共计50 µL，‑20℃保存备用；（7）阳性样品Aaa病菌DNA：四种不同甘蔗赤条病菌Acidovorax avenae subsp. avenae （Aaa）株系 HE、H、E1、E2 病菌原DNA作为标准样品，1 ng/µL，50 µL/瓶，‑20 ℃保存备用；（8）阴性样品DNA：无Aaa感染的甘蔗叶片总DNA为阴性对照，100 ng/µL，50 µL/瓶，‑20 ℃保存备用；（9）无核酸酶无菌水：2×10 mL/瓶。