[发明专利]树鼩角膜内皮细胞的体外分离及纯化方法有效
| 申请号： | 201610690263.9 | 申请日： | 2016-08-19 |
| 公开（公告）号： | CN106244549B | 公开（公告）日： | 2019-11-29 |
| 发明（设计）人： | 代解杰;苗雨润;宋庆凯;罕园园;匡德宣;孙晓梅;仝品芬;陆彩霞;王文广;李娜 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院医学生物学研究所 |
| 主分类号： | C12N5/079 | 分类号： | C12N5/079;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 53100 昆明正原专利商标代理有限公司 | 代理人： | 陈左<国际申请>=<国际公布>=<进入国 |
| 地址： | 650106 *** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | 本发明公开一种树鼩角膜内皮细胞的体外分离及纯化方法，经树鼩角膜内皮原代细胞的分离、纯化、CECs的传代培养，得到角膜内皮细胞。分离得到的角膜内皮细胞具有较高的细胞活力，在传至P3代可以实现树鼩角膜内皮细胞的纯化，纯化的细胞具有典型的内皮细胞形态，经NSE免疫荧光鉴定，染色率高。该方法纯化效率大大提高，价格低廉、使用方便，可以获得大量树鼩角膜内皮细胞。实现树鼩角膜内皮细胞的体外培养，填补了目前没有针对树鼩这一物种特定的角膜内皮原代细胞体外培养技术的空白，本发明提供的原代细胞的取材及纯化方法操作简单，价格低廉，体外培养的树鼩角膜内皮细胞可以在长期的传代培养过程中维持良好的细胞形态。 | ||
| 搜索关键词： | 角膜 内皮 细胞 体外 分离 纯化 方法 | ||
【主权项】：
1.一种树鼩角膜内皮细胞的体外分离及纯化方法，其特征在于：包括下列步骤：/n（1）树鼩角膜内皮原代细胞的分离：/n将成年树鼩死体的后弹力层完整撕下，加入3mL消化液，置于37℃的摇床上消化2h后以1500rpm离心10min，用培养液冲洗3次后重悬细胞，再以1500r/min离心10min，弃上清，加入5mL培养液吹打混匀后移至25cm2培养瓶中，将沉淀吹打混匀，在37℃、5%CO2的条件下培养25～30d，隔日换培养液，得到培养样品；/n（2）树鼩角膜内皮细胞的纯化：/n将步骤（1）所得培养样品，使用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化1～2min，显微镜下观察到大部分成纤维细胞变圆、悬浮后用含10%FBS的DMEM/F12细胞培养液终止消化，反复吹打后弃掉消化下来的细胞，再用PBS冲洗3次后添加培养液继续培养，24h后全量换液，以后隔天换液；/n（3）CECs的传代培养：/n待步骤（2）培养的细胞生长至80%融合度后，用0.25%胰酶消化按1:2传代培养，传至P5代的角膜内皮细胞；/n所述步骤（1）的消化液是含胶原酶75μg/mL、中性蛋白酶20μg/mL、DTT 0.5mg/mL和FBS1%的DMEM低糖培养基；/n所述步骤（1）、（2）的培养液是经下列操作制得：将Ham’s F12培养液与M199培养液按1:1质量比混合，再加入5%FBS、20μg/mL抗坏血酸钠、5μg/L胰岛素、1%ITS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，5ng/mL EGF，添加10μmol/L的TGF-β抑制剂，即得到培养液。/n
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