[发明专利]一种降低烟草转基因苗污染率并促进其快速生根的培养方法

摘要

本发明涉及烟草转基因方法技术领域，具体是公开了一种降低烟草转基因苗污染率并促进其快速生根的培养方法。以烟草叶片为受体，通过根癌农杆菌介导的方法，利用选择培养基筛选获得抗性试材，促进其快速生根成苗；烟草叶片和农杆菌在含有200μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌悬浮侵染液中侵染处理20分钟，可以顺利脱除愈伤组织上附着的根癌农杆菌，而不影响受体生长；共培养3天后使用附加1g/L头孢霉素和200mg/L二硫苏糖醇的液体共培养基清洗，可显著降低受体污染率，提高转化效率；含有200mg/L头孢霉素和50mg/LKan的选择分化培养基可以快速产生愈伤组织和大量芽点；将1‑3cm长的不定芽转入生根培养基有利于快速形成根系。

主权项

1.一种降低烟草转基因苗污染率并促进其快速生根的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)、外植体的制备及侵染取生长状态良好的本生烟草叶片，避开主脉和叶边缘切成1cm*1cm的小块，放置MS培养基上预培养2‑3天，放入含有200μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌悬浮侵染液侵染20分钟，过程中间每隔5分钟摇动培养皿一次，然后倒出菌液，用灭过菌的吸水纸吸干外植体表面菌液，转入固体共培养基中，28℃黑暗条件下倒置培养，共培养3天后使用附加1g/L头孢霉素和200mg/L二硫苏糖醇的液体共培养基清洗；(2)、抗性材料的筛选将上述清洗后的外植体转移到选择分化培养基上进行继代培养至外植体边缘产生大量愈伤组织和芽点；(3)、根系培育待上述不定芽长至1‑3cm长后转入生根培养基中；所述步骤(1)中的固体共培养基为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.2mg/L盐酸吡哆醇、0.2mg/L烟酸、150mg/L肌醇、200μmol/L的乙酰丁香酮，1mg/L的萘氧乙酸、4％的蔗糖和0.25％的Gelrite；所述步骤(2)中的选择分化培养基为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.2mg/L盐酸吡哆醇、0.2mg/L烟酸、150mg/L肌醇、0.2mg/L的TDZ、2mg/L的2,4‑D、25mg/L的4‑IPOAA、5mg/L的天冬氨酸、10g/L椰乳、200mg/L头孢霉素和50mg/L卡那霉素、4％的麦芽糖和0.28％的Gelrite；所述步骤(3)中的生根培养基为1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.2mg/L盐酸吡哆醇、0.2mg/L烟酸、150mg/L肌醇、100mg kg‑1ABT、0.2mg/L的TDZ和0.5mg/Lα‑萘乙酸钠、10g/L椰乳、1％的葡萄糖、3％的蔗糖和0.28％的Gelrite。