[发明专利]一种口腔咽拭子细菌宏基因组DNA提取方法

摘要

本发明提供一种口腔咽拭子细菌宏基因组DNA提取方法，包括口腔咽拭子的前处理、细菌裂解、DNA的分离和杂蛋白的去除，硅胶膜纯化柱吸附DNA以及杂质的去除，DNA洗脱这五个步骤提取口腔咽拭子细菌基因组DNA。本发明特殊的样本处理方式，可以大大提高得率。同时，使用超声波破碎裂解结合酶裂解，利用恰当的破壁时间和温和的条件，使革兰氏阴性菌和阳性菌及其他细菌适当破壁，又能使基因组DNA不受过强的物理因素导致断裂。本发明仅用1.5h就可以提取口腔咽拭子细菌宏基因组DNA，且细菌宏基因组得率更高。

主权项

1.一种口腔咽拭子细菌宏基因组DNA提取方法，其特征在于：所述方法包括如下：（1） 用超声波细胞破碎仪对口腔咽拭子及其保存液中的细菌进行初步裂解；（2）向拭子样品中加入裂解液和酶液进行裂解；（3）向步骤（2）的样品中加入酚‑氯仿‑异戊醇混合液，震荡离心取上清液；(4)将上述步骤（3）中的上清液中加入等体积的氯仿‑异戊醇混合液混匀，离心取上清液；（5）向步骤（4）的上清液中加入乙醇；（6）将上述步骤（5）的上清液移入硅胶膜纯化柱，离心弃滤过液；（7）在上述步骤（6）的硅胶膜纯化柱中加入去蛋白液，离心弃滤过液；（8）在上述步骤（7）的硅胶膜纯化柱中加入漂洗液，离心弃滤过液；（9）用洗脱液将上述步骤（8）硅胶膜上的DNA洗脱下来；步骤（1）中的样品为400 μl口腔咽试子保存液及口腔咽拭子；步骤（2）中的裂解液的用量为500 μl，包含浓度为100 mM的Tris，浓度为20 mM的EDTA，质量浓度3%的SDS，pH=8.0；酶液包含50 mg/ml 溶菌酶和 25 mg/ml蛋白酶K，用量50μl；步骤（3）中的酚‑氯仿‑异戊醇混合液的用量为500 μl，其成分酚‑氯仿‑异戊醇体积比为25：24：1；步骤（4）中的氯仿‑异戊醇混合液的体积比为24：1；步骤（5）中的乙醇质量浓度为82%，用量为步骤（4）中上清液体积的两倍；步骤（7）的去蛋白液包含浓度9 mM Tris，浓度8 mM、pH=7.0盐酸胍，使用前需要加乙醇，使得最终去蛋白液中无水乙醇质量浓度为35%；最终去蛋白液用量为500 μl；步骤（8）的漂洗液包含浓度 8 mM Tris，浓度 17 mM NaCl，pH=8.0，加入无水乙醇使漂洗液中乙醇质量浓度为90%；漂洗液用量为500 μl；步骤（9）的洗脱液用量为40‑80 μl，包含浓度 8 mM Tris，浓度 2 mM EDTA，pH=8.0。