[发明专利]基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法有效
申请号: | 201610702614.3 | 申请日: | 2016-08-19 |
公开(公告)号: | CN106290280B | 公开(公告)日: | 2018-11-09 |
发明(设计)人: | 潘道东;付田;陈伟;吴振;孙杨赢;曹锦轩;曾小群 | 申请(专利权)人: | 宁波大学 |
主分类号: | G01N21/64 | 分类号: | G01N21/64 |
代理公司: | 宁波奥圣专利代理事务所(普通合伙) 33226 | 代理人: | 何仲 |
地址: | 315211 浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | 本发明公开了基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法,特点是包转移到高压反应釜中制备得到CdSe QDs溶液;(2)首先在发夹探针A的一端标记AuNPs,其次在发夹探针A的另一端标记CdSe QDs,得到probe A溶液,同理得到probe B溶液;(3)分别将DNA1、DNA2加入到PBS缓冲液中混匀反应,再加入三聚氰胺标准样品混匀反应;最后分别加入probe A、probe B和probe C混匀反应,通过酶标仪测得一系列不同浓度的三聚氰胺标准样品溶液的荧光光谱图,根据两者的定量关系,确定待测样品中三聚氰胺的含量,优点是简便快速、灵敏度高以及特异性强。 | ||
搜索关键词: | 基于 连接 量子 胶体 dna 结构 快速 检测 三聚 方法 | ||
【主权项】:
1.一种基于连接量子点和胶体金的Y型DNA结构快速检测三聚氰胺的方法,其特征在于包括以下步骤:(1)CdSe QDs的制备A.将390mg硒粉和189mg硼氢化钠加入到4mL超纯水,将容器置于冰浴中反应24h,得到硒前驱体,将其避光放置于4℃冰箱中备用;B.将570mg 2.5水合氯化镉完全溶解于148mL超纯水中,再加入0.5mL巯基丙酸,用1M氢氧化钠调节pH至7.5,得到镉前驱体;C.先将制备的镉前驱体置于三颈烧瓶中,在N2保护下,向三颈烧瓶中迅速注入制备好的硒前驱体上清液2mL,10min后将反应后的溶液快速转移到高压反应釜中,通过控制反应温度为180℃,反应时间为220min,得到粒径为4‑6nm的CdSe QDs溶液;(2)发夹探针两端标记AuNPs和CdSe QDsA.发夹探针A两端相应标记AuNPs和CdSe QDs:将10μL 5μM的发夹探针A、3μL 1mM的三(2‑羧乙基)膦和3μL 1.5M的醋酸缓冲液分别加入到洁净的小玻璃瓶中,混匀,避光振荡反应1h;然后加入200μL胶体金溶液,混匀,振荡反应1h;再加入20μL 100μM dATP溶液,混匀,振荡反应1h;再加入40μL 0.1M NaCl溶液,混匀,室温反应0.5h,置于冰箱中4℃过夜;最后离心取沉淀,在沉淀中加入200μL PBS缓冲液,混匀得到一端标记了AuNPs的发夹探针A;分别取70μL CdSe QDs溶液、5μL 100ppb的碳化二亚胺盐酸盐溶液和5μL 100ppb的羟基琥珀酰亚胺溶液混匀,活化0.5h后,用50kDa的超滤离心管在13000rpm下离心10min,取超滤离心管中的溶液加双蒸水至原体积,放入4℃冰箱备用;再将一端标记了AuNPs的发夹探针A与活化好的CdSe QDs溶液混匀,室温反应2h,最后采用PBS缓冲液为重悬液,将混合液离心重悬,得到两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe A溶液,于4℃冰箱备用;B.取发夹探针B重复上述步骤,首先在发夹探针B的一端标记AuNPs,其次在发夹探针B的另一端标记CdSe QDs,得到两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe B溶液,于4℃冰箱备用;(3)三聚氰胺的检测分别将20μL1μM DNA1溶液和20μL 3μM DNA2溶液加入到50μL0.01M PBS缓冲液中混匀,室温反应30min;再加入三聚氰胺标准样品,混匀,室温反应40min;最后分别加入30μL 4μM的两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe A溶液,30μL 4μM的两端相应标记AuNPs和CdSe QDs的probe B溶液和30μL 4μM的probe C溶液,混匀反应90min,通过酶标仪测得一系列不同浓度的三聚氰胺标准样品溶液的荧光光谱图,扫描波长从450nm到700nm,得到三聚氰胺浓度与荧光强度之间的定量关系,根据两者的定量关系,确定待测样品中三聚氰胺的含量,其中所述的DNA1的碱基序列为:5'‑GCA CTA CTC CCT AAC ATC TCA AGC ACC CCG ATG GCG GTC CAG TTC TAC GGT AAG CTC ATA TGC CGG ACG TAG AGA CTG GGG AG‑3';所述的DNA2的碱基序列为:5'‑CTG GAC CGC CAT CGG GGT GCT TGA‑3';所述的probe A的碱基序列为:5'‑SH‑GCT TGA GAT GTT AGG GAG TAG TGC TCC AAT CAC AAC GCA CTA CTC CCT AAC ATC‑NH2‑3';所述的probe B的碱基序列为:5'‑NH2‑AGG GAG TAG TGC GTT GTG ATT GGA AAC ATC TCA AGC TCC AAT CAC AAC GCA CTA‑SH‑3';所述的probe C的碱基序列为:5'‑GTT GTG ATT GGA GCT TGA GAT GTT GCA CTA CTC CCT AAC ATC TCA AGC TCC AAT‑3'。
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