[发明专利]检测基因Ⅳ型戊型肝炎病毒抗体的间接ELISA方法

摘要

本发明公开了一种检测基因Ⅳ型戊型肝炎病毒抗体的间接ELISA方法，步骤包括：1)构建重组表达质粒pET42a‑ORF3，将pMD18T‑ORF3质粒和pET42a(+)原核表达载体转化DH5a感受态细胞，涂布于LB固体培养基上过夜；挑取单菌落接种于LB培养液中过夜；36小时后离心，收集菌体，提取质粒DNA；在连接酶的作用下，将双酶切后的ORF3片段与pET42a(+)原核表达载体进行连接，获得重组表达质粒pET42a‑ORF3；2)对重组表达质粒pET42a‑ORF3诱导表达和纯化；3)得到成功表达了His/GST‑ORF3融合蛋白，即可用于血清学调查。本发明的方法，成本低，准确率高。

主权项

一种检测基因Ⅳ型戊型肝炎病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于，按照以下步骤实施：步骤1、构建重组表达质粒pET42a‑ORF3将pMD18T‑ORF3质粒和pET42a(+)原核表达载体转化DH5a感受态细胞，取50uL菌液涂布于LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜；12小时后，挑取单菌落接种于3mL的LB培养液中，37℃振荡过夜；36小时后，在12000rpm状态下离心2分钟，收集菌体，提取质粒DNA；对pMD18T‑ORF3质粒和pET42a(+)原核表达载体采用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切，在T4 DNA ligase连接酶的作用下，将双酶切后的ORF3片段与pET42a(+)原核表达载体进行连接，获得重组表达质粒pET42a‑ORF3；步骤2、对重组表达质粒pET42a‑ORF3诱导表达和纯化将正确插入目的基因的重组表达质粒pET42a‑ORF3转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单菌落，同时设转化空载体质粒的大肠杆菌BL21为对照，置于5mL的LB培养液中，37℃振摇过夜；12小时后，将其以1：100的比例振摇培养至OD600＝0.4‑0.6时，无菌取出lmL菌液作为诱导前对照，给剩余的菌液中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，30℃继续振摇培养4小时，在12000rpm状态下离心1分钟收集菌体；弃上清，沉淀加入等体积的2倍样品缓冲液，充分混匀，沸水中加热5分钟，在12000rpm状态下离心1分钟；取上清，以未诱导菌体为对照，进行SDS‑PAGE电泳检测；对表达条件进行优化，确定诱导表达的最佳条件；步骤3、利用镍离子亲和层析柱纯化His/GST‑ORF3融合蛋白，分别收集洗脱液，取各部分样品进行SDS‑PAGE分析，观察蛋白纯化效果，得到成功表达了His/GST‑ORF3融合蛋白，即可用于血清学调查。