[发明专利]一种体外活化人记忆性B细胞成浆细胞的培养方法

摘要

一种体外活化人记忆性B细胞成浆细胞的培养方法，是利用已辐照的3T3‑CD40L细胞作为饲养层细胞，10%FBS的IMDM作为基础培养液，IL‑2、IL‑21作为生长因子，体外诱导记忆B细胞活化成浆细胞并分泌抗体的过程。本发明所述培养方法操作简单，成本较低，所需记忆B细胞数量少，活化效率以及活化质量高。

主权项

一种体外活化人记忆性B细胞成浆细胞的培养方法，其特征是：(1)记忆性B细胞的获取：无菌环境下采集志愿者的全血，用淋巴细胞分离液从新鲜的抗凝全血中分离出人外周血单核细胞，再使用人记忆性B细胞磁珠分选试剂盒从外周血单核细胞中分离出记忆性B细胞；(2)记忆性B细胞的体外活化培养：将分选所得的记忆B细胞按照0细胞/孔、5细胞/孔、20细胞/孔的密度接种96孔细胞培养板，10%FBS的IMDM作为基础培养液，培养液中含30ng/mL的IL‑2和60ng/mL的IL‑21以及5000cGy 的60Co照射灭活的3T3‑CD40L细胞以10000/孔作为饲养层细胞，在37℃，5%CO2条件下培养13d，让记忆性B细胞活化成为可以分泌抗体的浆细胞；(3)ELISA检测记忆性B细胞体外活化成浆细胞后分泌性的IgG抗体：收集步骤（2）中的细胞培养上清，使用Goat Anti‑Human Kappa 蛋白和Goat Anti‑Human Lambda蛋白包被酶标板，采用酶联免疫吸附测定方法检测记忆性B细胞的培养基上清，确定IgG抗体的分泌量;具体步骤如下：（A）用50µL/孔包被液将Goat Anti‑Human Kappa 蛋白和Goat Anti‑Human Lambda蛋白,各100ng/孔,包被酶标板，4℃过夜，洗板机洗板5遍，洗液为含0.05% Tween的PBS；（B）用封闭液200µL /孔，37℃封闭2h，洗板5遍；（C）分别在对应孔中加入细胞培养上清，或者梯度稀释的IgG标准品，同时用水或PBS作为阴性对照，50µL/孔，37℃放置1h，洗板5遍；（D）分别在对应孔中加入1:5000稀释的HRP标记的Goat Anti‑Human IgG，以及1:10000稀释的Goat x‑human IgG‑Fc Fragment HRP Conjugated 50µL/孔，37℃放置45min，洗板5遍；（E）加入显色液100µL/孔，室温避光显色15min；（F）加入2mol/L硫酸50µL/孔，终止显色反应，检测OD450nm，参考波长为630nm，表5为Elisa检测细胞培养上清IgG的OD值。