[发明专利]一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用

摘要

本发明公开了一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法及应用，其扩增步骤包括植物预处理、植物样本总DNA提取、样本16S rRNA基因的扩增和基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析，样本16S rRNA基因的扩增包括16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增和16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增，基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析包括植物内生细菌16S rRNA基因扩增子纯化回收、扩增子测序文库构建、Illumina HiSeq测序和测序数据生物信息学分析。该基因扩增方法用于高通量测序的植物病害检测及植食性动物肠道微生物检测。本发明采用高通量测序技术进行植物内生细菌的测序分析，数据量更大，检测结果更完整，而且最大程度降低了植物宿主的污染，结果多样性更高，而且成本低。

主权项

1.一种植物内生菌16S rRNA基因扩增方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)植物预处理：取植物样本0.5‑1g，经超声清洗后在超净台中使用有效率浓度2％的次氯酸钠溶液浸泡消毒4‑6min，使用无菌水冲洗一遍后使用体积百分比为70‑75％的乙醇溶液浸泡25‑35s，随后使用无菌水冲洗3‑5遍彻底去除样本表面消毒剂；(2)植物样本总DNA提取：通过表面消毒的样本经液氮研磨均匀后转至1.5ml离心管中，通过CTAB法纯化样本总DNA；(3)样本16S rRNA基因的扩增：包括16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增和16SrRNA基因高变区/保守区扩增子扩增；31)16S rRNA基因全长的乳液PCR扩增①设计三对引物AP1429/F‑R，MTR/F‑R和CHP/F‑R均以原核生物和植物16S rRNA基因为模板，其中MTR/F‑R和CHP/F‑R引物3’末端以C3spacer或C5spacer修饰，下划线标记碱基为锁核酸修饰基团，用于抑制植物宿主来源的污染，AP1429/F‑R引物对用于植物内生细菌16S rRNA基因的扩增；②配置植物内生细菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液，该混合液由体积为1:1的乳液发生剂和PCR扩增缓冲液混合而成；所述乳液发生剂由含有质量分数为94.9％矿物油、4.5％Span 80、0.5％吐温80、0.1％Triton X‑100构成，所述PCR扩增缓冲液由0.4μM引物、2.5mM氯化镁、0.2mM dNTPs、1U Taq DNA聚合酶以及DNA模板组成；③将步骤②用于扩增植物内生细菌16S rRNA基因的乳液PCR混合液移入0.2mL PCR管中并置于带有热盖功能的PCR仪中，在PCR以上运行以下反应循环：95℃ 1min，1个循环；98℃ 5s，68‑70℃ 1min，55℃ 30s，68‑72℃ 1min，25个循环；68‑72℃ 5min，1个循环；25℃恒温；④向步骤③每个PCR管的反应产物中添加10％体积的2‑丁醇，震荡混匀后以13200×g离心4‑6min，离心完成后取下层水相溶液为模板进行16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增，结果检测通过吸取5μL反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测结果，以不加MTR(F/R)和CHP(F/R)引物对的PCR产物作为阳性对照，回收目的条带；32)16S rRNA基因高变区/保守区扩增子扩增：以31)中的④步骤水相反应产物为模板，使用引物U515F:5’‑GTGCCAGCMGCCGCGGTAA‑3’和E806R:5’‑GGACTACCAGGGTATCTAAT‑3’在PCR扩增缓冲液中，在95℃1min，1个循环；98℃5s，55℃30s，68‑72℃30s，20个循环；68‑72℃5min，1个循环；25℃恒温的PCR循环条件下完成，结果通过吸取该步骤反应产物5μL在琼脂糖凝胶电泳中检测；PCR扩增缓冲液由40mM Tris‑HCl pH8.0、40mM KCl、3mM MgCl2、5％甘油、1％吐温20、1mM dNTPs、1个单位的KOD DNA聚合酶、10μM U515F、10μM E806R和1μL的31)步骤④水相反应产物构成；(4)基于Illumina平台的高通量测序及生物信息分析：包括植物内生细菌16S rRNA基因扩增子纯化回收、扩增子测序文库构建、Illumina HiSeq测序和测序数据生物信息学分析；41)植物内生细菌16S rRNA基因扩增子纯化回收将步骤32)的反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，使用QIAquick凝胶回收试剂盒切胶回收片段大小在280‑300bp之间的目标条带，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段；使用2％琼脂糖电泳检测，检测条件5V/cm，20min；42)扩增子测序文库构建文库构建使用Illumina公司TruSeq DNA PCR‑Free Sample Prep Kit；43)Illumina HiSeq测序测序平台为Illumina HiSeq 2500，测序模式为V2SBS快速250PE模式；44)测序数据生物信息学分析测序得到的PE reads用FLASH软件进行拼接，同时对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列操作过程后完成数据过滤，得到供后续分析的高质量目标序列，后续生物信息学操作使用QIIME、Usearch或Mothur完成，统计和作图使用R完成，操作步骤如下：a、根据Barcode区分样品；b、使用Uchime去除嵌合体；c、在97％的相似性水平上使用UPARSE算法进行OTU的聚类；d、挑选出OTU的代表性序列；e、使用Greengene或Silva数据库进行物种分类信息的划分。