[发明专利]一种高温大曲浸提液宏蛋白提取纯化方法

摘要

本发明涉及一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法。方法是高温大曲粉碎后喷无菌水混匀放置生物培养箱阶段升温法进行活化培养备用；加入乙酸‑乙酸钠缓冲液和苯甲基磺酰氟溶液，振荡混匀后浸提过夜，过滤，离心得到高温大曲浸提液；依次加入TCA‑丙酮溶液、乙酸铵甲醇溶液、丙酮溶液、Tris饱和酚/十二烷基硫酸钠缓冲液、乙酸铵甲醇溶液、甲醇和丙酮溶液，相应得到A沉淀、B沉淀、酚层、C沉淀、D沉淀和高温大曲宏蛋白质样品；加入样品裂解液，冰浴超声助溶，离心弃沉淀物得到高温大曲宏蛋白样品液。本方法制备的高温大曲宏蛋白样品液可以应用于高温大曲宏蛋白的双向电泳，得到高分辨率，高重复性的双向电泳图谱。

主权项

1.一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法，其特征在于：1）高温大曲的活化培养：在高温大曲的曲块上，按照五点取样法取高温大曲300g粉碎后过40目筛子得到高温大曲曲粉，喷20‑40g无菌水混匀，放置生物培养箱阶段升温法进行24小时活化培养备用；2）高温大曲浸提液制备：称取30g经过活化培养的高温大曲曲粉，加入90ml的乙酸‑乙酸钠缓冲液和90μL苯甲基磺酰氟溶液，振荡混匀后置于4℃条件下浸提过夜，然后用4层纱布过滤，滤液离心20 min，取上清液即为高温大曲浸提液；3）Tris‑丙酮‑酚改良法提取取10ml高温大曲浸提液于离心管内，加入‑20℃预冷40mlTCA‑丙酮溶液混合；振荡摇匀后在‑20℃冰箱中放置2 小时，离心30 min，弃上清，收集A沉淀；在A沉淀中，加入5ml 乙酸铵甲醇溶液浸没，振荡3‑5分钟后，在‑20℃冰箱放置30min，离心10 min，收集B沉淀；在B沉淀中，加入10ml丙酮溶液清洗，然后置于真空干燥仪中，使丙酮完全挥发后，加入5ml 1：1体积比的 Tris饱和酚/十二烷基硫酸钠缓冲液，振荡15‑20分钟后，离心，收取浅色上层酚层；在酚层中加入乙酸铵甲醇溶液，酚层：乙酸铵甲醇溶液体积比1：5，放置过夜，离心10 min，收取C沉淀；在C沉淀中加入10ml甲醇，振荡清洗5分钟，离心10min，收取D沉淀；在D沉淀中，加入10ml丙酮溶液清洗，使丙酮完全挥发，得到高温大曲宏蛋白质样品；4）超声波裂解在高温大曲宏蛋白质样品中，加入0.5‑1.0ml样品裂解液，浸没高温大曲宏蛋白质样品，冰浴超声助溶30min，离心15 min，弃沉淀物得到高温大曲宏蛋白样品液；所述的阶段升温法是指在30℃条件下活化培养8小时，升温至35℃活化培养6小时，再升温至40℃活化培养6小时，最后再升温45℃活化培养4小时；所述的样品裂解液是通过以下过程配制的：尿素10.5g，硫脲3.8g，CHAPS 1g，pH 3‑10的IPG Buffer 500μL，DTT 154mg加水溶解后定容到 25mL，每1.5mL EP 管中分装样品裂解液1mL，在‑20℃冰箱中保存备用。