[发明专利]小斑叶兰的离体保存方法

摘要

本发明提供一种颇具药用价值的近危植物小斑叶兰的离体保存方法，选择野外生长发育良好和没有病虫害的小斑叶兰果荚，经表面消毒处理后破开果荚，将种子接种在种子萌发培养基上，获得无菌小苗，转入丛芽增殖培养基，经过丛芽增殖获得丛生芽，经生根和离体保存培养基诱导后，直接将带苗的培养瓶转入温度为13±2℃条件下培养。本发明的通过对野外采集外植体、种子萌发、丛生芽诱导、离体保存和保存苗恢复生长等步骤，建立了小斑叶兰的快繁和离体保存体系，继代周期达3年左右。本发明的小斑叶兰的离体保存方法对斑叶兰属植物种质资源的开发、利用和保护提供重要的理论来源和技术支持。 1

主权项

1.小斑叶兰的离体保存方法，选择野外生长发育良好和没有病虫害的小斑叶兰果荚，经表面消毒处理后破开果荚，将种子接种在种子萌发培养基上，获得无菌小苗，转入丛芽增殖培养基，经过丛芽增殖获得丛生芽，经生根和离体保存培养基诱导后，将培养瓶口用保鲜膜缠绕数圈封严，直接将带苗的培养瓶转入温度为13±2℃条件下培养，实现离体保存，经离体保存的植株去除枯黄的部分，转入恢复生长培养基中进行恢复生长，实现离体保存和快速增殖的转换，培养基和培养条件如下：(1)种子萌发培养基为：花宝1号3g/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.8g/L；(2)丛芽增殖培养基为：MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.8g/L；(3)生根和离体保存培养基为：1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.8g/L+活性炭0.3g/L；(4)恢复生长培养基为：1/2MS+IBA0.5mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.6g/L，所述1/2MS指仅大量元素为MS的1/2，其余元素和用量同MS培养基，以上培养基的pH均为5.8，除离体保存培养温度为13±2℃，其余培养条件均为23±2℃；光照强度10‑20μmol/(m²·s)，光照12h/d。

2.如权利要求1所述的小斑叶兰的离体保存方法，其特征在于所述培养所用的培养瓶为白色透明玻璃瓶，直径7.5cm×高9.0cm，容积300ml。

3.如权利要求1所述的小斑叶兰的离体保存方法，其特征在于种子萌发培养、丛芽增殖培养、恢复生长培养所用的培养基为40ml，离体保存培养所用的培养基为60ml。

4.如权利要求1所述的小斑叶兰的离体保存方法，其特征在于取野外自然生长、没有病虫害的小斑叶兰果荚，在果荚成熟但未开裂之前采摘带回实验室，用纱布擦洗果荚表面，再用75％酒精进行表面消毒20‑30s，然后用无菌水冲洗3遍，用0.1％HgCl₂水溶液消毒10‑15min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，滤纸吸干果荚表面水分，然后用无菌解剖刀切开果荚，将种子散落到种子萌发培养基(1)：花宝1号3g/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.8g/L中；接种1周后，种子开始陆续萌发，7周后，出现叶原基分化，然后将带有2‑3片叶子的小斑叶兰小苗接种至丛芽增殖培养基(2)：MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.8g/L上，4周后出现芽分化，逐渐形成丛生芽，继续在此培养条件下继代培养2‑3次，30天继代一次，增殖率达1∶4，待新增殖的丛芽长高到4‑5cm，再将其转接在生根和离体保存培养基(3)：1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.8g/L+活性炭0.3g/L上进行生根诱导，每瓶接种5个，4周后，出现带白色根毛的根，并伴随少量气生根，将培养瓶口用保鲜膜密封数圈，直接移入培养温度为13±2℃的条件进行离体保存，继代周期延长至3年，保存3年的小苗除顶部3‑4片叶子保持绿色外，其余叶片基本枯黄，但茎仍为灰绿色，将以上离体保存后的小斑叶兰植株去除枯黄的部分，转入恢复生长培养基(4)：1/2MS+IBA0.5mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.6g/L中进行恢复生长，8周重新启动增殖，直至形成细小丛芽，再将这些丛芽转入丛芽增殖培养基(2)中，重新进行快速增殖，实现离体保存和快速增殖的转换。