[发明专利]一种无患子体细胞胚同步化的悬浮培养方法

摘要

本发明公开了一种无患子体细胞胚同步化的悬浮培养方法，包括以下步骤：以无患子无菌苗的不定根为外植体，诱导胚性愈伤组织产生；调整继代培养基成分，获得适于悬浮培养的愈伤组织；建立无患子体细胞悬浮培养体系；通过多方面条件优化，建立无患子体细胞胚同步化培养体系。本发明为实现无患子人工种子的规模化生产提供了保障，同时也为无患子优良株系的规模化生产、种质保存和品种改良提供了强有力的技术支撑。

主权项

一种无患子体细胞胚同步化的悬浮培养方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：以野外无患子株系快繁后获得的无菌苗的不定根为外植体，切成0.2‑0.8cm大小的切段，接种于诱导培养基中进行胚性愈伤组织的诱导；其中，诱导培养基具体为添加有2.0‑4.0mg/L IAA、0.1‑1.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂的WPM固体培养基；步骤2：挑选步骤1中获得的胚性愈伤组织，转接于增殖培养基中进行胚性愈伤组织的增殖，获得适于悬浮培养的胚性愈伤组织；步骤3：挑选步骤2中获得的适于悬浮培养的胚性愈伤组织，转接于添加有植物生长调节剂的WPM液体培养基中进行悬浮培养；其中，添加有植物生长调节剂的WPM液体培养基具体为添加有0.5‑1.0mg/L IAA、0.3‑1.0mg/L TDZ、2‑15mg/L亚精胺、300‑500mg/L CH和30g/L蔗糖的WPM液体培养基；步骤4：培养20‑30d后，将步骤3中获得的悬浮培养细胞进行继代增殖培养；其中，悬浮细胞的继代增殖培养采用的培养基具体为添加有0.5‑1.0mg/L IAA、0.3‑1.0mg/L TDZ、2‑15mg/L亚精胺、300‑500mg/L CH和30g/L蔗糖的WPM液体培养基；步骤5：将步骤4中增殖后获得的无患子悬浮细胞，转接于液体胚状体诱导培养基中进行胚状体的诱导；其中，液体胚状体诱导培养基具体为添加有0.5‑2.0mg/L ZT、0.1‑0.6mg/L TDZ、2‑15mg/L亚精胺、300‑500mg/L CH和30g/L蔗糖的WPM液体培养基；步骤6：将步骤5中诱导的胚状体转接于液体成熟培养基中进行胚状体的成熟培养；其中，液体成熟培养基具体为添加有0.05‑0.2mg/L IBA、0.05‑0.5mg/L GA₃和30g/L蔗糖的1/2WPM液体培养基。