[发明专利]一种a-酮戊二酸的分离纯化方法

摘要

本发明涉及一种a‑酮戊二酸的分离纯化方法，具体涉及一种针对L‑谷氨酸经过L‑谷氨酸氧化酶的转化制备a‑酮戊二酸，对含有a‑酮戊二酸转化液的分离纯化方法。包括离子交换、纳滤、活性炭脱色、反渗透浓缩、浓缩结晶和干燥。本发明采用膜分离、纳滤脱色、膜浓缩等先进处理工艺节省了能耗，节省了活性炭的用量，减少了对环境的污染，降低了生产成本，提高了产品质量。

主权项

1.一种a‑酮戊二酸的分离纯化方法，具体步骤如下：离子交换：将含有a‑酮戊二酸转化液经D301大孔弱碱性阴树脂吸附后用水反洗树脂至流出液清澈，用0.25N盐酸溶液洗脱；纳滤：采用600‑800分子量纳滤膜过滤a‑酮戊二酸洗脱液纯化液得到a‑酮戊二酸纳滤清液，用3倍浓缩液体积的去离子水分3次清洗浓缩液后，弃去浓缩液，收集含a‑酮戊二酸的纳滤透析液；活性炭脱色：pH 3.0，用活性炭进行脱色，活性炭的用量为a‑酮戊二酸纳滤透析液的1%，脱色温度为50℃，脱色时间为30min，用0.22μm滤膜过滤得脱色液；反渗透浓缩：将a‑酮戊二酸脱色液经反渗透膜浓缩至原体积一半得到a‑酮戊二酸预浓缩液；浓缩结晶：将预浓缩液在真空度≥0.095，蒸发温度50℃条件下浓缩至含量≥80%的浓缩液，将浓缩液搅拌冷却至20℃结晶5h；干燥：结晶结束后，抽滤获得晶体，将结晶晶体50℃真空干燥，得到a‑酮戊二酸成品；所述含有a‑酮戊二酸转化液的制备方法，具体步骤如下：粗酶液的制备：将L‑谷氨酸氧化酶的发酵液先经过陶瓷膜过滤，去除菌体，上清液再经过反渗透膜浓缩50倍即为酶转化使用的L‑谷氨酸氧化酶的粗酶液；转化培养：在pH为8.5的磷酸缓冲液中，添加L‑谷氨酸氧化酶的粗酶液、H2O2酶和MnCl2以及底物L‑谷氨酸钠，37℃，200r/min 转化 24 h，即得含a‑酮戊二酸的转化液；磷酸缓冲液的终浓度为50mmol，L‑谷氨酸氧化酶的终浓度为15U/ml, H2O2酶的终浓度为20U/ml、MnCl2的终浓度为5mmol，L‑谷氨酸钠的终浓度为10%；利用菌株 MQO‑160 制备L‑谷氨酸氧化酶的方法，步骤如下：斜面培养：将菌株 MQO‑160 在无菌条件下接种到斜面培养基上进行倒置培养，培养温度为28℃，培养时间为48h；种子扩大培养：从步骤（1）的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为 10%，v/v，扩大培养的温度为 28℃，摇床转速 120r/min，培养时间为12h；发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10%，v/v，扩大培养温度30℃，摇床转速150r/min，发酵周期36h；30L 发酵罐培养：将步骤（3）中发酵培养后的发酵液接种到 30L发酵罐的发酵培养基中，接种量为10%，v/v，控制罐压强为0.05MPa，在28℃条件下培养 48 小时，搅拌转速为400rpm，风量为10 L/min，发酵后得含有L‑谷氨酸氧化酶的发酵液；所述菌株MQO‑160的保藏编号为：CGMCC No.12892；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2016 年8月22日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1 号院3 号。