[发明专利]一种微生物酶法生产a‑酮戊二酸的方法

摘要

本发明涉及一种微生物酶法生产a‑酮戊二酸的方法，包括（1）粗酶液的制备：将L‑谷氨酸氧化酶的发酵液先经过陶瓷膜过滤，去除菌体，上清液再经过反渗透膜浓缩50倍即为酶转化使用的粗酶液；（2）转化培养：在磷酸缓冲液中，添加粗酶液、H₂O₂酶和MnCl₂以及一定浓度底物L‑谷氨酸钠，37℃，180r/min 转化 24 h，即得含有a‑酮戊二酸的转化液。本发明中L‑谷氨酸经过L‑谷氨酸氧化酶的转化制备a‑酮戊二酸。本发明采用一步酶促反应，转化液中添加过氧化氢酶，避免了转化过程过氧化氢对L‑谷氨酸氧化酶的抑制作用，从而影响a‑酮戊二酸的转化合成，使a‑酮戊二酸可以积累到较高的浓度。

主权项

一种微生物酶法生产a‑酮戊二酸的方法，其特征在于，生产方法的具体步骤如下：（1）粗酶液的制备：将L‑谷氨酸氧化酶的发酵液先经过陶瓷膜过滤，去除菌体，上清液再经过反渗透膜浓缩50倍即为酶转化使用的L‑谷氨酸氧化酶的粗酶液；（2）转化培养：在pH为8.5的磷酸缓冲液中，添加L‑谷氨酸氧化酶的粗酶液、H₂O₂酶和MnCl₂以及底物L‑谷氨酸钠，37℃，200r/min 转化 24 h，即得含a‑酮戊二酸的转化液；磷酸缓冲液的终浓度为50mmol，L‑谷氨酸氧化酶的终浓度为15U/ml, H₂O₂酶的终浓度为20U/ml、MnCl₂的终浓度为5mmol，L‑谷氨酸钠的终浓度为10%；所述L‑谷氨酸氧化酶的发酵液的制备方法如下：（1）斜面培养：将菌株 MQO‑160 在无菌条件下接种到斜面培养基上进行倒置培养，培养温度为28℃，培养时间为48h；（2）种子扩大培养：从步骤（1）的斜面培养基上挑取菌落，加水稀释获得菌体溶液，将菌体溶液接种到种子培养基上进行扩大培养，接种量为 10%（v/v），扩大培养的温度为 28℃，摇床转速 120r/min，培养时间为12h；（3）发酵培养：将扩大培养后的菌体接种到发酵液体培养基中，接种量为10%（v/v），扩大培养温度30℃，摇床转速150r/min，发酵周期36h；（4）30L 发酵罐培养：将步骤（3）中发酵培养后的发酵液接种到 30L发酵罐的发酵培养基中，接种量为10%（v/v），控制罐压强为0.05MPa，在28℃条件下培养 48 小时，搅拌转速为400rpm，风量为10 L/min，发酵后得含有L‑谷氨酸氧化酶的发酵液；所述菌株MQO‑160的保藏编号为：CGMCC No.12892；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期为：2016 年8月22日；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路 1 号院3 号。