[发明专利]一种虎杖愈伤组织低温处理植株技术

摘要

本发明公开了一种虎杖愈伤组织低温处理植株技术，即以虎杖种子诱导得到的愈伤组织为材料建立了虎杖离体超低温保存技术体系，从而有效地保护了虎杖优良种质资源。本发明经过愈伤组织诱导、预培养、装载、脱水、冷冻、洗涤、再培养及再生等过程实现了虎杖愈伤组织超低温保存，可作为一种长期稳定保存种质资源的方法，降低保存经济成本，有效地保护了珍稀种质资源。

主权项

一种虎杖愈伤组织低温处理植株技术，其特征在于包括以下工艺步骤：步骤 （1）外植体的处理：选取当年收饱满的虎杖种子，以洗洁精水刷洗，置于自来水中冲洗32min后置于清水中浸泡13h，再转入125mg/mL的赤霉素溶液中浸泡16h，然后在超净工作台中以75%乙醇溶液浸泡32s，无菌水冲洗6次，再用含有0.06%吐温‑20的0.6%升汞溶液消毒11min，无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸干表面的水分后备用；步骤（2）愈伤组织诱导：用无菌解剖刀在经步骤（1）处理后的种子上割刀造成伤口后接种到诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，接种后在26℃条件下进行全暗培养直至形成愈伤组织；步骤（3）预培养：将步骤（2）得到的长势良好的愈伤组织转接至预培养基中进行预培养，接种后在6℃条件下培养6天后检测细胞存活率；步骤（4）装载处理：将经步骤（3）处理后存活的愈伤组织切成2cm左右大小，放入12mL冷冻管后加62%玻璃化保护剂PVS2在室温下装载处理42min；步骤（5）脱水及冷冻：将经步骤（4）处理后的愈伤组织转至预冷至1℃的100%的玻璃化保护剂PVS2中在6℃处理62min后将冷冻管投入液氮中冷冻处理；步骤（6）化冻及洗涤：愈伤组织在液氮中保存26h后，取出冷冻管，在42℃水浴中化冻，化冻过程中不断振荡冷冻管，使管内愈伤组织和保护剂受热均匀,然后用含1.2mol/L的MS培养液在室温下洗涤6次，每次12min；步骤（7）再培养：将经化冻后的愈伤组织用无菌水冲洗9次后立即转移至继代培养基中进行增殖培养，接种后先在29℃条件下全暗培养22天，然后每天光照18小时，光照强度为3200lx，培养温度为29℃的条件下培养；步骤（8）芽诱导：将步骤（7）培养至22天的长势良好的愈伤组织转接至分化培养基中进行不定芽诱导，接种后先在29℃条件下全暗培养6天，然后每天光照18小时，光照强度为1800lx，培养温度为29℃的条件下培养直至形成不定芽；步骤（9）生根培养：当丛生芽长至3.6cm高时，将丛生苗切割成单苗接种至生根培养基中进行生根培养，接种后先在29℃条件下全暗培养5天，然后每天光照18小时，光照强度为1800lx，培养温度为29℃的条件下培养直至长出根；步骤（10）试管苗移栽：当小苗长出的新根系长达3.6cm，并且长出侧根，苗高6cm以上时，将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗8天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入由黄沙土和火碳泥（1：1）混合成的基质并定植于大田中。