[发明专利]一种利用DGGE鉴定混合中药粉末组成物种的方法

摘要

本发明涉及混合中药粉末组成物种的鉴定。该技术包括以下步骤：提取混合中药粉末基因组DNA，用特异性GC发卡结构改造的特异性引物进行PCR扩增；PCR扩增产物在变性凝胶中电泳分离，染色，作DGGE分析得到DGGE变性凝胶电泳条带；切取单一DNA条带，回收DNA，进行第二轮PCR扩增；所得DNA序列进行序列拼接、裁切，并提交至公共数据库进行序列比对，以最高的序列相似度物种为鉴定结果，以区分混合中药粉末物种组成。本发明方法成功地将DNA条形码与DGGE技术结合，弥补了DNA条形码不能鉴定混合中药粉末的缺陷，有效地解决了混合中药粉末或复方制剂的组成物种的鉴定和中药掺伪鉴别的问题。具有快速、准确、重复性高、成本低等优点。

主权项

一种鉴定混合中药粉末组成物种的方法,其特征在于，包括以下步骤：(1)基因组DNA的提取：提取混合中药粉末样品的基因组DNA；(2)选择及改造引物：选择与中药粉末DNA条形码相应的通用引物；并在引物对中正向引物的5`端加上特异性的GC发卡结构，所述的发卡结构长度40bp，序列为5`‑CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG‑3`，得特异性引物；(3)第一轮PCR扩增:以步骤(1)所得的基因组DNA作为模板，以步骤(2)所得的引物进行PCR扩增；(4)DGGE分析：将所得PCR扩增产物用于DGGE分析，在变性凝胶中电泳分离；电泳分离结束后，将变性凝胶染色，并置于凝胶成像仪中做成像检测，得到DGGE变性凝胶电泳条带；(5)DNA凝胶回收及第二轮PCR扩增：在所得的DGGE变性凝胶电泳条带上切取单一DNA条带，回收DNA，并利用步骤(2)的通用引物进行第二轮PCR扩增；(6)测序和数据分析：将步骤(5)所得的PCR扩增产物直接用于DNA测序；所得DNA序列进行序列拼接、裁切，并提交至公共数据库进行序列比对，以最高的序列相似度物种为鉴定结果，区分混合中药粉末物种组成。