[发明专利]一种检测粪类圆线虫病的纳米金免疫层析试纸及制备方法

摘要

本发明提供了一种检测粪类圆线虫病的纳米金免疫层析试纸及制备方法，所述试纸包括底板，底板一面依次粘有样品垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫、保护膜；所述检测垫为硝酸纤维膜，其上设置包括质控线和检测线，所述质控线上包被有兔抗鼠单克隆抗体，所述检测线上包被有粪类圆线虫‑牛清血蛋白偶联物；所述纳米金结合垫上包被有纳米金标记的抗粪类圆线虫单克隆抗体。本发明试纸用于检测粪类圆线虫病，操作简单，灵敏度高，为粪类圆线虫病的早中期检查提供了很好的依据，弥补了本病在该技术领域不易被检测的问题。

主权项

1.一种检测粪类圆线虫病的纳米金免疫层析试纸，其特征在于，所述试纸包括底板，底板一面依次粘有样品垫、纳米金结合垫、检测垫、吸水垫、保护膜；所述检测垫为硝酸纤维膜，其上设置包括质控线和检测线，所述质控线上包被有兔抗鼠单克隆抗体，所述检测线上包被有粪类圆线虫抗原‑牛清血蛋白偶联物；所述纳米金结合垫上包被有纳米金标记的抗粪类圆线虫单克隆抗体；所述底板为PVC胶板；所述样品垫经处理液处理，所述处理液为Tris溶液，还含有1.5％的牛血清白蛋白、1.2％的PVP、0.9％的Tween20，pH调节在7‑8；所述保护膜在试纸最上层，其检测端印有MAX标记线，所述检测线位于靠近MAX标记线的位置，所述质控线位于远离MAX标记线的位置；所述粪类圆线虫抗原是将粪类圆线虫丝状蚴在抗菌培养液中于常温下培养30h，分离出丝状蚴虫体，冷冻真空粉碎后用离心法离心过滤出上清液，灭菌后封存；所述抗粪类圆线虫单克隆抗体是以粪类圆线虫抗原‑牛清血蛋白偶联物为免疫原制备而得；所述的纳米金是通过柠檬酸钠还原法制备而得，所述制备的纳米金直径为15nm；所述的纳米金标记抗体的制备方法为：取纳米金溶液10mL，加入抗粪类圆线虫单克隆抗体25μg，搅拌5min后加入0.5mL浓度为8％的氯化钠溶液和质量浓度为5％的胎牛血清，胎牛血清的加入量为使总溶液最终浓度为0.9％，先低速离心10min，除去纳米金颗粒沉淀，再以较高转速4℃下离心30min，所得沉淀物加到原体积的0.015m磷酸盐缓冲液中，调节pH在7.8，离心处理2‑4次，所得沉淀溶解于原体积15％的上述磷酸盐缓冲溶液中，4℃保存，即为纯化的纳米金标记的抗粪类圆线虫单克隆抗体；所述检测粪类圆线虫病的纳米金免疫层析试纸制备方法为：步骤一：将样品垫经处理液处理，所述处理液为Tris溶液，还含有1.5％的牛血清白蛋白、1.2％的PVP、0.9％的Tween20，pH调节在7‑8；步骤二：纳米金结合垫制备方法：(1)纳米金标记抗体的制备方法为：取纳米金溶液10mL，加入抗粪类圆线虫单克隆抗体25μg，搅拌5min后加入0.5mL浓度为8％的氯化钠溶液和质量浓度为5％的胎牛血清，胎牛血清的加入量为使总溶液最终浓度为0.9％，先低速离心10min，除去纳米金颗粒沉淀，再以较高转速4℃下离心30min，所得沉淀物加到原体积的0.015m磷酸盐缓冲液中，调节pH在7.8，离心处理2‑4次，所得沉淀溶解于原体积15％的上述磷酸盐缓冲溶液中，4℃保存，即为纯化的纳米金标记的抗粪类圆线虫单克隆抗体，备用；(2)将(1)中制备好的纯化的纳米金标记的抗粪类圆线虫单克隆抗体均匀喷涂于玻璃纤维膜上，冷冻后干燥处理，即为纳米金结合垫，备用；步骤三：硝酸纤维素膜的包被方法为：在硝酸纤维素膜上划出检测线和质控线的位置，将粪类圆线虫抗原‑牛清血蛋白偶联物和兔抗鼠单克隆抗体用包被缓冲液配制成0.3‑0.6mg/mL的包被液，用点喷方式将包被液分别包被到硝酸纤维膜上的检测线和质控线上，检测线上喷涂包被有粪类圆线虫抗原‑牛清血蛋白偶联物，质控线上喷涂包被有兔抗鼠单克隆抗体，备用；步骤四：试纸制备：将样品垫、纳米金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和保护膜依次相互叠加粘贴在底板上，36‑40℃下干燥处理后用斩切机切成3mm宽的试纸条，包封，即为所述检测粪类圆线虫病的纳米金免疫层析试纸。