[发明专利]利于多糖‑ADH衍生物质量控制的工艺

摘要

本发明公开了一种利于多糖‑ADH衍生物质量控制的工艺，包括流脑A群菌种的培养、发酵、纯化，以及流脑A群荚膜多糖的活化和衍生；其中，流脑A群菌种的培养、发酵、纯化具体为：开启流脑A群菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO₂培养；将培养得到的流脑A群种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养后接种入发酵罐后，恒温36.5℃，深层通气240rpm搅拌培养，培养流脑A群细菌至对数生长期后期或静止期前期，甲醛杀菌后去除菌体，收集上清液；纯化后得到多糖，且苯酚的用量为粗糖的3/4（v/v）。本发明所示优化后的工艺一方面控制流脑A群发酵液中的核酸及蛋白等杂质成分含量较低，另一方面降低苯酚的用量。

主权项

利于多糖‑ADH衍生物质量控制的工艺，其特征在于，包括以下步骤：1）开启菌种及传代：开启流脑A群菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO₂培养，二代采用半综合固体培养基培养，三代采用流脑半综合液体培养基在恒温振荡摇床中培养；2）接种到种子罐培养：将上述步骤1）培养得到的流脑A群种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养，培养至第五代；3）发酵罐发酵：将上述步骤2）培养得到的流脑A群五代种子接种入发酵罐后，恒温36.5℃，深层通气240rpm搅拌培养，中途补加葡萄糖溶液为流脑A群细菌生产荚膜多糖提供原料，培养流脑A群细菌至对数生长期后期或静止期前期，此时菌浓度达到100‑200亿/mL，甲醛杀菌后去除菌体，收集发酵液上清液；4）一次纯化：加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖，沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和十六烷基三甲基溴化铵解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%（v/v），2‑8℃静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75‑80%（v/v），充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，得到粗糖；5）二次纯化：将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按粗糖与苯酚之比为4:3（v/v）的比例加入苯酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提1‑3次至上清液澄清，收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸，超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%（v/v），充分混匀后2‑8℃静置过夜，沉淀多糖，离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次；6）流脑A群荚膜多糖的活化和衍生：将CDAP用乙腈溶解成100mg/mL的溶液，称取上述步骤5）二次纯化后得到的多糖400mg，溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/mL的溶液，调节pH至9.0，按多糖：CDAP=1：0.5的比例加入CDAP，室温搅拌2‑5分钟，将ADH用0.2M NaHCO₃溶解成100mg/mL的溶液，按多糖：ADH=1：3.5的比例加入，室温搅拌1小时，反应结束后，用0.05mol/L 氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除溴化氰。