[发明专利]一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂及其制备方法，其特征在于用具有纤维素，木质素，半纤维素分解功能的污色原毛平革菌，桔绿木霉，米曲霉，和具有生物防治功能解淀粉芽孢杆菌，普纳链霉菌复合发酵制成。该腐熟菌剂能够有效地加速还田香蕉茎叶残体的腐烂速度，同时能够抑制香蕉枯萎病等病原菌的生长。田间施用该腐熟菌剂后香蕉茎叶残体分解速度加快，其中香蕉茎叶残体失重率显著增加、香蕉茎叶残体拉力显著降低;土壤病原菌拮抗芽孢杆菌与放线菌数量显著增加，病原性微生物数量显著降低。

主权项

一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂，其特征在于，所述抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂主要由以下几种菌：污色原毛平革菌，桔绿木霉，米曲霉，解淀粉芽孢杆菌，普纳链霉菌发酵制成；其具体的制备方法，包括以下步骤：步骤一，复合曲霉菌粉的制备A、污色原毛平革菌种子液的制备：取出污色原毛平革菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6‑8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.01亿cfu/ml，即为污色原毛平革菌种子液；B、桔绿木霉种子液的制备：取出桔绿木霉菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养6天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养4‑6天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为桔绿木霉种子液；C、米曲霉种子液的制备：取出米曲霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养5天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养5‑7天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为1亿cfu/ml，即为米曲霉种子液；D、混合发酵：将上述制备的污色原毛平革菌种子液、桔绿木霉种子液与米曲霉种子液以2：1：1的比例混合均匀后，以2%的接种量接种至灭菌的曲霉固体发酵培养基上，菌种与固体培养基混合均匀后，将接好种的曲霉固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5‑10cm，控温28‑32℃，湿度保持为60%‑75%，发酵6‑10天，检测其总孢子含量不低于20亿CFU/g，检测其污色原毛平革菌孢子含量不低于10亿CFU/g，木质素过氧化物酶活，即LiP酶活不低于200U/ g；锰依赖过氧化物酶，即MnP酶活不低于500U/ g；纤维素酶含量不低于500IU/ g，木聚糖酶含量不低1000IU/ g，即可低温风干，水分含量低于10%，即得到复合曲霉菌粉；其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；其中，所述的曲霉固体发酵培养基：香蕉茎叶渣85%，棉粕2%，玉米芯8%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%‑60%；各培养基灭菌的条件为：0.10‑0.15MPa，121℃灭菌30分钟；步骤二、解淀粉芽孢杆菌菌粉的制备取出解淀粉芽孢杆菌保藏管，用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为320L/min ，30℃培养16‑24小时，待总菌含量不低于20亿cfu/ml，即可作为芽孢杆菌液体种子；发酵：将上述制备的芽孢杆菌液体种子加至芽孢固体发酵培养基中，混匀，在浅盘上发酵，堆料厚度为5‑10cm，控制发酵温度为30‑40℃，发酵36‑48小时，待芽孢含量不低于100亿cfu/g，即可晒干，待水分含量低于10%，即得到解淀粉芽孢杆菌菌粉；其中，所述营养肉汁固体培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20 g，水1000mL，pH7.2；其中，所述液体种子培养基：葡萄糖8g/L，玉米粉10 g/L， 豆粉10 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.1 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钠1.0 g/L，pH7.0；其中，芽孢固体发酵培养基：香蕉茎叶渣60%，麸皮35%，棉粕2%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%‑60%；各培养基灭菌的条件为：0.10‑0.15MPa，121℃灭菌30分钟；步骤三，普纳链霉菌菌粉的制备取出普纳链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6‑8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为普纳链霉菌种子液；发酵：将上述制备的普纳链霉菌种子液以5%的接种量接种至灭菌的普纳链霉菌固体发酵培养基上，菌种与普纳链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的普纳链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5‑8cm，控温28‑32℃，前两天空气湿度保持为60%‑75%，过后空气湿度保持为40%‑50%，发酵4‑6天，检测其孢子含量不低于10亿CFU/g，即可低温风干，即得到普纳链霉菌菌粉；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7.2～7.4；其中，所述的普纳链霉菌固体发酵培养基：香蕉茎叶渣80%，棉粕2%，玉米粉1%，石粉10%，麸皮7%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%‑60%；各培养基灭菌的条件为：0.10‑0.15MPa，121℃灭菌30分钟；步骤四 将复合曲霉菌粉、解淀粉芽孢杆菌菌粉、普纳链霉菌菌粉与棉粕粉以1：1：1：1的比例混合均匀，检测其污色原毛平革菌孢子含量不低于2亿CFU/g，木质素过氧化物酶活不低于40U/ g；锰依赖过氧化物酶活不低于100U/ g；纤维素酶含量不低于100IU/ g，木聚糖酶含量不低200IU/ g，解淀粉芽孢含量不低于20亿CFU/g，普纳链霉菌含量不低于2亿CFU/g，即可包装成品。