[发明专利]一种非同位素标记肽段加入法结合MRM的蛋白质定量方法

摘要

本发明公开了一种非同位素标记肽段加入法结合质谱多反应监测技术(MRM)的蛋白质定量方法，包括以下步骤：S1：MRM‑MS方法的建立与优化；首先通过UNIPROT数据库获取蛋白的全部序列，然后通过Skyline软件建立和优化MRM质谱监测的肽段和监测方法；S2：非同位素标记肽段加入法结合MRM技术的绝对定量新方法建立；(1)标准肽段标准溶液制备：合成选好的标准肽段，将蛋白的标准肽段干粉用30‑35％的乙腈、0.1‑0.5％的甲酸和70‑75％的水溶液溶解配置成为100‑110pmol/L的储备液；(2)血清样本制备：用Agilent亲和小柱去除高丰度蛋白；(3)配置适量浓度的标准肽段标准溶液和内标多肽，加入血清样品中，用MRM‑MS的方法进行检测并使用标准外推法计算蛋白含量。

主权项

一种非同位素标记肽段加入法结合质谱多反应监测技术(MRM)的蛋白质定量方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：MRM‑MS方法的建立与优化；首先通过UNIPROT数据库获取蛋白的全部序列，然后通过Skyline软件建立和优化MRM质谱监测的肽段和监测方法；S2：非同位素标记肽段加入法结合MRM技术的绝对定量新方法建立；(1)标准肽段标准溶液制备：合成选好的标准肽段，将蛋白的标准肽段干粉用十万分之一电子天平精密称量，然后用30‑35％的乙腈、0.1‑0.5％的甲酸和70‑75％的水溶液溶解配置成为100‑110pmol/L的储备液；(2)血清样本制备：首先取血清10‑15μL，然后加入190‑200μL的Agilent BuffeA，混匀，接着将其置于超滤管中，离心10‑15min，将滤液加入至Hu‑7HC小柱上，离心30‑40s，收集滤液，再加入Agilent BuffeA，离心1‑1.5min，收集滤液，计算滤液体积，合并后的滤液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，然后根据测得溶液的蛋白浓度吸取50‑60μg的蛋白溶液，置于超滤管中，离心15‑20min，接着加入200‑210μL的Urea和100‑110μL的DTT，在37‑42℃下于混匀仪中搅拌60‑70min，接着加入20‑25μL的IAA，暗反应30‑35min，离心10‑15min，滤去溶液，再加入NH4HCO3和胰酶，在37‑42℃下酶切过夜，离心10‑15min后冻干；3)分析方法验证；定量标准曲线：首先配制混合标准肽段血清样品溶液：取10‑15pmol/μL的混合非标记肽段储备液等体积混合，然后用流动相A稀释成系列标准肽段水溶液(2.5、5、10、20、50、100fmol/μL)，接着加入等体积的1‑3μg/μL的正常血清蛋白酶切液，分别配成标准肽段血清样品溶液，在标准肽段血清样品溶液中分别加入50‑55fmol的β半乳糖苷酶酶切产物作为内标多肽，然后用建立的MRM‑MS方法进行测定，用内标多肽校正测得的血清中标准多肽的浓度；方法精密度：分别配制1‑5、10‑15和50‑55fmol/μL的低中高三种浓度的混合标准肽段血清样品溶液，然后分别加入50‑55fmol的β半乳糖苷酶酶切产物作为内标多肽，用建立的MRM‑MS方法进行测定，用内标多肽校正测得的血清中标准多肽的浓度，用外推法血清中标准多肽的浓度，并计算各浓度值的RSD值，考察方法的定量精密度。(4)用建立的MRM‑MS方法对各样品进行液相色谱分离和质谱分析,每份样品均加入三种不同浓度的标准多肽和内标多肽β半乳糖苷酶酶切产物，加入的标准多肽浓度为样品浓度的1、2、4倍。用内标多肽校正测得的血清中标准多肽的浓度。以测出的各标准多肽浓度汇制一条曲线，曲线外推至横轴所得浓度即为样本浓度。