[发明专利]水貂阿留申病阳性血清标准品及其制备方法

摘要

本发明公开了一种水貂阿留申病阳性血清标准品及其制备方法。本发明采用水貂阿留申病病毒毒VR‑870病毒提取液作为抗原，对家兔耳缘静脉注射和皮下注射在家兔的头、颈、背部两侧及足部进行免疫接种，采血制备血清。本发明将采血得到的血液用包含10％小牛血清的PBS缓冲液稀释，过夜后提取血清，使制备的阳性血清更加均匀、稳定。本发明的水貂阿留申病阳性血清标准品具有高血清抗体效价，100％的高阳性检测率，高均匀性和稳定性等特点，适合作为检测水貂阿留申病的阳性血清标准样品。

主权项

1.一种水貂阿留申病阳性血清标准品的制备方法，包括如下步骤：(1)抗原：水貂阿留申病病毒毒株VR‑870病毒提取液作为抗原；(2)动物免疫：对体重为2‑3kg、水貂阿留申病病毒阴性的成年雌性家兔，进行3～5次免疫接种：第1次免疫接种：用弗氏完全佐剂乳化的VR‑870病毒提取液，对家兔耳缘静脉注射和皮下注射在家兔的头、颈、背部两侧及足部进行免疫接种；第2～5次免疫接种：距前一次免疫接种后第10～15天，用弗氏不完全佐剂乳化的VR‑870病毒提取液，对家兔耳缘静脉注射和皮下注射在家兔的头、颈、背部两侧及足部进行免疫接种；(3)最后一次免疫接种后第7～15天开始，采血测定抗体效价，确定抗体效价为1：104以上，采血制备血清；(4)先后经0.45μm和0.22μm无菌滤膜加压过滤血清，滤液无菌分装，得水貂阿留申病阳性血清标准品，所述阳性血清标准品抗体效价为1：104以上；所述VR‑870病毒提取液的制备方法包括如下步骤：将已长满单层的CRFK细胞用0.05％胰酶消化，悬浮于含10％胎牛血清的MEM培养基中，以1～2×106个细胞/细胞瓶分装，待细胞长至培养单层约80％面积时，倒掉培养基，加入VR‑870病毒冻存液，31.8℃感作1h，再用无血清的MEM培养基清洗两次，覆盖含2％血清的MEM维持液；31.8℃，5％CO2培养箱继续培养，测得病毒增殖液浓度TCID50为10‑8.5/0.1mL，直至细胞病变达到80％时，反复冻融3次后，在4℃、10000rpm下离心10min，得上清液；将上清液在4℃、27000r/min下超速离心4h后，用0.01mol/L PBS悬浮沉淀，得浓度为5mg/mL的VR‑870病毒提取液；在步骤(3)中，采血得到的血样，通过包含10％小牛血清的PBS缓冲液稀释成两倍，混合均匀，置于20℃下1h后，在4℃过夜，取上层液，在4℃、4000rpm下离心10min，收集上层的血清。