[发明专利]一种同时检测两种肿瘤标志物的电化学方法

摘要

本专利公开了一种同时检测两种肿瘤标志物的电化学方法，涉及电化学检测技术领域。利用目标物与适配体特异性结合的作用力大于适配体与其DNA互补序列之间的作用力这一特点，使得两种目标物分别与电极上的捕获探针竞争结合各自的适配体，从而达到目标物特异性识别以及检测目标物转化的目的；通过将两种金属离子示踪物引入到检测体系中结合电化学检测方法，实现两种目标物信号的差别输出。本方法响应速度快、检测灵敏度高。

主权项

1.一种同时检测两种肿瘤标志物的电化学方法，其特征是包括以下步骤：（1）两种金属离子示踪物的制备两种金属离子示踪物的制备包含三个步骤；首先是金/牛血清白蛋白复合物的制备，其步骤如下所述：40 ~ 60 mg 牛血清白蛋白在磁力搅拌下溶解到10 mL超纯水中，然后10 mL 浓度为10 ~ 30 mM 的氯金酸溶液加入到上述溶液中并在室温下搅拌5 min，最后，快速加入50 mg的抗坏血酸粉末，反应5 min，所得固态产物用乙醇和水洗涤数次，4 ºC保存；其次是金/牛血清白蛋白‑金属离子的制备，其步骤如下所述：将0.5 mL浓度为40 mg mL‑1的金/牛血清白蛋白复合物溶液分别分散在10 mL 浓度分别为10 mM 的硝酸铅溶液和硝酸镉溶液中，搅拌24 h后离心、洗涤数次，将所得产物分别分散于2 mL超纯水中；最后是示踪DNA连接过程，其步骤如下所述：先将浓度均为10 µM的巯基修饰示踪DNA 1和示踪DNA 2溶液分别在95 ºC下加热0.5 h，然后在25 ºC下放置1 h，之后将处理好的示踪DNA 1溶液加入到金/牛血清白蛋白‑铅离子溶液中，示踪DNA 2溶液加入到金/牛血清白蛋白‑镉离子溶液中；至此，两种金属离子示踪物DNA‑金/牛血清白蛋白‑铅离子和DNA‑金/牛血清白蛋白‑镉离子制备完成；示踪DNA1具体核苷酸序列为ttagcagttg atcctttgga taccctgg，示踪DNA2具体核苷酸序列为tacccacgat accagcttat tcaattcgtg g；（2）DNA预变性适配体1和适配体2，以及巯基修饰的捕获探针1和捕获探针2在95 ºC下分别加热0.5 h；将这四种溶液在25 ºC下放置1 h；其中，适配体的英文名称为aptamer；适配体1具体核苷酸序列为gcagttgatc ctttggatac cctgg，适配体2具体核苷酸序列为ccacgatacc agcttattca attcgtgg，捕获探针1具体核苷酸序列为ccagggtatc caaaggatca actgc，捕获探针2具体核苷酸序列为ccacgaattg aataagctgg tatcgtgg；（3）电极修饰过程该步骤每一步修饰完成后都使用浓度为0.01 M、pH 7.4的磷酸缓冲溶液清洗，孵育温度均为25 ºC；首先，分别将10 µL 浓度为2 µM的捕获探针1和捕获探针2溶液滴加到预处理过的金电极上，孵育过夜；滴加5 µL 浓度为1 mM的巯基己醇，孵育2 h；分别滴加10 µL 浓度均为2 µM的适配体1和适配体2溶液，孵育6 h；分别将体积为5 µL一系列浓度的两种肿瘤标志物溶液滴加到电极上，孵育1 h；分别取体积为10 µL 的DNA‑金/牛血清白蛋白‑铅离子和DNA‑金/牛血清白蛋白‑镉离子溶液滴加到电极上，孵育 1 h；将10 µL 浓度为1 mM的Ru(NH3)63+滴加到电极上；（4）电化学检测电化学检测采用微分脉冲伏安法，其扫描电压范围为0.9 ~ 0.3 V，所用电解液是pH 为4.5的醋酸/醋酸钠缓冲溶液。