[发明专利]区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5 AIV的PCR-RFLP方法

摘要

本发明公开一种区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4 H5AIV的PCR‑RFLP方法。包括以下步骤：1)从检测样品中提取病毒基因组RNA；2)用引物P1和P2对clade 2.3.4和clade 2.3.4.4病毒进行RT‑PCR扩增，得到相应的HA基因片段；3)取RT‑PCR扩增产物经Bal I酶切后进行RFLP分析。本发明的方法仅需上游引物P1和下游引物P2，并仅需常规限制性内切酶Bal I进行RFLP酶切后加以鉴别，无需复杂繁琐的条件优化过程，本发明在clade 2.3.4和clade2.3.4.4H5 AIV快速鉴别诊断上快捷准确，可填补国内外相关领域的研究空白。

主权项

1.一种区别clade 2.3.4和clade 2.3.4.4H5AIV的PCR‑RFLP方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从检测样品中提取clade 2.3.4和clade 2.3.4.4H5AIV基因组RNA；2)用引物P1和P2同时对clade 2.3.4和clade 2.3.4.4H5AIV基因组RNA进行RT‑PCR扩增，得到相应的HA基因片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小为538bp和529bp，肉眼无法进行区别；3)取RT‑PCR扩增产物，经Bal I酶切后进行RFLP分析；所述步骤2)的扩增引物的序列为：上游引物P1：5’‑TTTCCGTTGGGACATCAA‑3’，下游引物P2：5’‑ACTCCATCTATTGCCTTTTG‑3’；所述步骤3)中，Bal I酶切位点位于clade 2.3.4.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增产物的221‑226位，clade2.3.4.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增产物可被切成2段，大小分别为223bp和306bp；而clade 2.3.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增片段中没有Bal I酶切位点，被酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍为538bp。