[发明专利]一种能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂

摘要

本发明公开了一种能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂，所述能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂主要由以下原料组成南方原毛平革菌菌粉，千叶链霉菌菌粉，生黑孢链霉菌菌粉，巴氏梭菌菌粉，弗留明拜叶林克氏菌菌粉，阿氏芽孢杆菌菌粉；本腐熟剂由具有纤维素，木质素，半纤维素分解功能的南方原毛平革菌，和具有抑制土传病害的千叶链霉菌，生黑孢链霉菌，具有强大的固氮能力的巴氏梭菌，弗留明拜叶林克氏菌，阿氏芽孢杆菌复合发酵制成。田间施用该腐熟菌剂后小麦秸秆分解速度加快，其中小麦秸秆失重率显著增加、小麦秸秆拉力显著降低；土壤病原菌拮抗芽孢杆菌与放线菌数量显著增加，病原性微生物数量显著降低，固氮菌显著增加。

主权项

一种能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂，其特征在于，所述能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂主要由以下组份组成：南方原毛平革菌菌粉20‑40份，千叶链霉菌菌粉10‑30份，生黑孢链霉菌菌粉10‑30份，巴氏梭菌菌粉20‑40份，弗留明拜叶林克氏菌菌粉10‑30份，阿氏芽孢杆菌菌粉20‑40份；其具体的制备方法，包括以下步骤：步骤一、南方原毛平革菌菌粉的制备南方原毛平革菌种子液的制备：取出南方原毛平革菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6‑8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.01亿cfu/ml，即为南方原毛平革菌种子液；发酵：将上述制备的南方原毛平革菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的小麦秸秆固体发酵培养基上，菌种与小麦秸秆固体发酵培养基混合均匀后，将接好种的小麦秸秆固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5‑8cm，控温28‑32℃，空气湿度保持为60%‑75%，发酵4‑6天，检测其孢子含量不低于15亿CFU/g，木质素过氧化物酶活，即LiP酶活不低于600U/ g；锰依赖过氧化物酶，即MnP酶活不低于800U/ g；即可低温风干，即得到南方原毛平革菌菌粉；其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；其中，所述的香蕉茎叶渣固体发酵培养基：小麦秸秆粉86%，豆粕粉2%，小麦次粉1%，石粉1%，玉米芯粉10%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%‑60%，各培养基灭菌的条件为：0.10‑0.15MPa，121℃灭菌30分钟；步骤二、千叶链霉菌粉的制备取出千叶链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6‑8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为千叶链霉菌种子液；二级种子扩培：将上述制备的千叶链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的千叶链霉菌液体二级种子培养基上，500L的发酵罐装液量为350L，通气量为每分钟液气比为1：0.8，28‑30℃培养36‑48小时，待菌体含量达到80g/L时，即可作为千叶链霉菌二级种子液；发酵：将上述制备的千叶链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的千叶链霉菌固体发酵培养基上，菌种与千叶链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的千叶链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5‑8cm，控温28‑32℃，前两天空气湿度保持为60%‑75%，过后空气湿度保持为40%‑50%，发酵4‑8天，检测其孢子含量不低于50亿CFU/g，即可低温风干，即得到千叶链霉菌菌粉；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7.2～7.4；其中，所述的千叶链霉菌二级液体种子培养基：豆粕粉2%，玉米粉2%，氯化钠0.2%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，PH7.2～7.4；其中，所述的千叶链霉菌固体发酵培养基：小麦秸秆粉83%，菜粕粉2%，面粉1%，石粉6%，麸皮8%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%‑60%，各培养基灭菌的条件为：0.10‑0.15MPa，121℃灭菌30分钟；步骤三、生黑孢链霉菌粉的制备取出生黑孢链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6‑8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为生黑孢链霉菌种子液；二级种子扩培：将上述制备的生黑孢链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的生黑孢链霉菌液体二级种子培养基上，500L的发酵罐装液量为350L，通气量为每分钟液气比为1：0.8，28‑30℃培养36‑48小时，待菌体含量达到80g/L时，即可作为生黑孢链霉菌二级种子液；发酵：将上述制备的生黑孢链霉菌二级种子液以10%的接种量接种至灭菌的生黑孢链霉菌固体发酵培养基上，菌种与生黑孢链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的生黑孢链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5‑8cm，控温28‑32℃，前两天空气湿度保持为60%‑75%，过后空气湿度保持为40%‑50%，发酵4‑6天，检测其孢子含量不低于40亿CFU/g，即可低温风干，即得到生黑孢链霉菌菌粉；其中，所述的高氏一号固体培养基与步骤二中高氏一号固体培养基相同；其中，所述的生黑孢链霉菌二级液体种子培养基：棉粕粉2%，玉米粉2%，氯化钠0.2%，碳酸钙1%，硫酸镁0.1%，PH7.2～7.4；其中，所述的生黑孢链霉菌固体发酵培养基：小麦秸秆粉80%，棉粕5%，玉米粉1%，石粉6%，麸皮8%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%‑60%，各培养基灭菌的条件为：0.10‑0.15MPa，121℃灭菌30分钟；步骤四、弗留明拜叶林克氏菌菌粉的制备取出弗留明拜叶林克氏菌菌种保藏管，用无氮固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养120小时，在平板下挑取单个菌落接种50毫升无氮液体培养基中，在培养箱中30℃震荡培养96小时，种子采用10%的接种量，接种至5L大三角瓶中，装液量为2L的二级无氮液体种子培养基，30℃震荡培养96‑120小时，检测其菌液浓度，活菌含量超过5亿cfu/ml，即可作为弗留明拜叶林克氏菌液体菌种接种至装有600L弗留明拜叶林克氏菌发酵培养基的1000L发酵罐中，接种量为10%，开搅拌120r/min，前24小时通气量为200L/min，24小时后通气量为480L/min ，30℃培养48‑64小时，待菌体含量不低于50亿cfu/ml，即可结束发酵，即得到弗留明拜叶林克氏菌菌液，利用草炭土以1：1吸附，风干至水分低于8%，即可为弗留明拜叶林克氏菌菌粉；其中，所述无氮固体培养基：KH2PO4 0.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.002g，酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，琼脂20 g，蒸馏水1.0L，pH 7.2；其中，所述二级无氮液体种子培养基：蔗糖20g，苹果酸5.0g,K2HPO4.H2O 0.lg,KH2PO4 .H20 0.4g，MgS04.7H2O 0.2g，NaCI 0.lg，Na2MO04 H20 0.002g，FeCl30.01 g，pH 7.0；其中，所述弗留明拜叶林克氏菌发酵培养基：面粉10g/L，甘蔗糖蜜40 g/L，氯化铵1 g/L，豆粕粉20 g/L，磷酸氢二钾0.2 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，钼酸钠0.01 g/L，氯化铁0.01 g，碳酸钙5g ，pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10‑0.15MPa，121℃灭菌30分钟；步骤五、巴氏梭菌菌粉的制备取‑80℃甘油管保藏的菌种1mL接种于装有9mLRCM培养基的试管中，37℃条件下静态厌氧活化48h，将活化好的菌种按1%(v/v)的接种量转接到灭过菌的100L巴氏梭菌种子培养基中，37℃条件下静态厌氧培养24h~36h，菌含量超过10亿CFU/ml，即可作为巴氏梭菌种子继续接种，将100L巴氏梭菌种子接至装有800kg已经灭菌的巴氏梭菌固体发酵培养基的1吨的发酵罐中，抽真空，37℃培养5‑10天，待巴氏梭菌产生芽孢，芽孢含量不低于40亿CFU/g，即可停止培养，晒干或风干；即为巴氏梭菌菌粉；其中，所述的RCM培养基：胰蛋白陈10g/L，牛肉膏10g，酵母膏10g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，可溶性淀粉1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5克/L，醋酸钠3g/L，pH7.0，121℃灭菌20min；其中，所述的巴氏梭菌种子培养基：:酵母膏15g/L，牛肉膏5g/L，KH2PO4 2g/L硫酸镁1g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，NaHCO3 1g/L，CaCO3 1g/L，葡萄糖20g/L， PH7.0，121℃灭菌20min巴氏梭菌固体发酵培养基：麸皮700kg，菜粕粉50kg，石粉10kg，粗玉米皮16kg，胰蛋白陈6kg，牛肉膏6kg，酵母膏6kg，葡萄糖3kg，氯化钠3kg，半胱氨酸盐酸盐0.5kg，醋酸钠1kg，料水比1：0.8，pH7.0，121℃灭菌20min；步骤六、阿氏芽孢杆菌菌粉的制备取出阿氏芽孢杆菌保藏管，用无氮芽孢固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养72小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮芽孢固体培养基，在30℃培养箱中培养72小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L阿氏芽孢杆菌种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为100L/min，8‑24小时后通气量为200L/min，24小时后通气量为300L/min ，30℃培养32‑48小时，待总菌数含量不低于25亿cfu/ml，即可作为阿氏芽孢杆菌种子液；发酵：将上述制备的阿氏芽孢杆菌种子液以10%‑20%的比例接种至阿氏芽孢杆菌固体培养基上，混匀，在浅盘上发酵，堆料厚度为5‑10cm，控制发酵温度为30‑40℃，发酵36‑48小时，待芽孢含量不低于80亿cfu/g，即可晒干，待水分含量低于10%，粉碎过100目筛，即得到阿氏芽孢杆菌菌粉；其中，所述无氮芽孢固体培养基：蔗糖10g，磷酸氢二钾0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，硫酸钙0.1g，碳酸钙5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2；其中，所述阿氏芽孢杆菌种子培养基：糖蜜20g/L，玉米淀粉10 g/L， 玉米浆粉40 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾0.6 g/L，碳酸钙10 g/L， pH7.0；各培养基灭菌的条件为：0.10‑0.15MPa，121℃灭菌30分钟；阿氏芽孢杆菌固体培养基：小麦秸秆粉35%，麸皮60%，棉粕2%，石粉1%，粗玉米皮2%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%‑60%；各培养基灭菌的条件为：0.10‑0.15MPa，121℃灭菌30分钟；步骤七、将上述步骤一至步骤六制备的南方原毛平革菌菌粉20‑40份，千叶链霉菌菌粉10‑30份，生黑孢链霉菌菌粉10‑30份，巴氏梭菌菌粉20‑40份，弗留明拜叶林克氏菌菌粉10‑30份，阿氏芽孢杆菌菌粉20‑40份按比例混合均匀，检测其南方原毛平革菌孢子含量不低于2亿CFU/g，木质素过氧化物酶活不低于100U/ g；锰依赖过氧化物酶活不低于120U/ g，千叶链霉菌含量不低于5亿CFU/g，弗留明拜叶林克氏菌含量不低于5亿CFU/g，巴氏梭菌芽孢含量不低于6亿CFU/g，阿氏芽孢杆菌芽孢含量不低于10亿CFU/g；即为能够抑制土传病害的具有固氮能力的秸秆腐熟剂。