[发明专利]一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法

摘要

本发明公开了一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，主要包含样品处理、菌落转印、抗原包被、封闭、洗涤加一抗、洗涤加二抗、斑点显色七个步骤；本发明的方法具有成本低、操作简便等优点，并且针对性强、灵敏度更高，经验证可高2‑3数量级；采用间接法比现在市售产品的直接法竞争法更易防干扰，不易产生假阳性，同时不依赖特定仪器，若定性检测，只需肉眼观测膜上斑点即可；本发明更可以实现产毒菌种的高通量快速筛选，为开发相应微生物源毒素产品助力。

主权项

一种检测与筛选产毒素菌的原位免疫方法，主要包含样品处理、菌落转印、抗原包被、封闭、洗涤加一抗、洗涤加二抗、斑点显色七个步骤，其特征在于，具体为：步骤一、样品处理：主要为用无菌水清洗河豚鱼,无菌条件下取出河豚鱼卵巢,加无菌水研磨,取匀浆后的组织液进行10倍系列稀释涂板法分离,然后进行恒温培养；步骤二、菌落转印：取与培养皿同等大小的NC膜用乙酸钠溶液(1N，Ph7.4)浸润,将长有菌落LB平板置于4℃，然后将无菌NC膜铺于长有菌落的平板上，并与菌落接触，直至NC膜完全浸湿，在3个或更多不对称位置上做好标记，用平口镊子将滤膜从琼脂面上揭下；26℃培养原平板，以便后期挑取产TTX阳性菌株；步骤三、抗原包被：将NC膜的菌落面向下,倒置于一块新的空平皿盖子上,平皿内加入37％甲醛溶液，封口膜密封平皿，置振荡器上，1hr,37℃。步骤四、封闭：将膜，用PBS‑T洗涤3次，每次3分钟，然后用牛血清封闭；步骤五、洗涤，加一抗：用PBS‑T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用一抗溶液10ml孵育；步骤六、洗涤，加二抗：用PBS‑T洗涤3次，每次3分钟，将膜置于平皿中用酶标二抗溶液10ml孵育；步骤七、斑点显色：用PBS‑T洗涤3次，每次3分钟，用10ml，1mg/mL pNPP溶液10ml孵育，10min,直至斑点可见。若用于定量检测，可置酶联免疫分析仪系统根据斑点亮度计算TTX含量。