[发明专利]一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法有效
| 申请号： | 201610788821.5 | 申请日： | 2016-08-31 |
| 公开（公告）号： | CN106381310B | 公开（公告）日： | 2020-02-04 |
| 发明（设计）人： | 沈鹤霄;华权高;马峰 | 申请（专利权）人： | 武汉华美生物工程有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85 |
| 代理公司： | 11302 北京华沛德权律师事务所 | 代理人： | 房德权 |
| 地址： | 430206 湖北省武汉市东*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加SV40T‑Antigen核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1‑RNAP质粒；(3)将待表达基因两端分别加入T7启动子，IRES和T7终止子，然后连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。本发明提高了哺乳表达系统的表达量。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 t7 噬菌体 rna 聚合 启动 子系统 哺乳动物 细胞 表达 蛋白 方法 | ||
【主权项】：
1.一种用T7噬菌体RNA聚合酶和T7启动子系统在哺乳动物细胞表达蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：/n(1)根据哺乳动物细胞偏爱密码子优化原始T7RNA聚合酶基因序列，在所述基因序列上、下游分别加入酶切位点，并在下游添加核定位序列；基因合成的T7RNA聚合酶基因序列如SEQ ID NO:1所示；/n(2)将所述合成的T7RNA聚合酶基因克隆到质粒pUC57中，通过酶切位点连接到pcDNA3.1真核表达载体上，构建得到pcDNA3.1-RNAP质粒；/n(3)将待表达基因连接到pUC57载体上，构建得到待表达基因的质粒；所述pUC57载体具有T7启动子、多克隆位点、IRES序列以及T7终止子；/n(4)将步骤(2)和(3)中得到的质粒作为双质粒共表达系统，以共转染真核细胞，以及表达蛋白。/n
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