[发明专利]一种检测生物膜表面吸附纳米颗粒的方法

摘要

本发明公开了一种检测生物膜表面吸附纳米颗粒的方法，该方法通过向细胞爬片上附着生长的生物膜中添加可发荧光的纳米颗粒，纳米颗粒结合在生物膜表面，通过光线全反射后在大数值孔径全内反射专用物镜上产生的衰逝波激发纳米颗粒产生荧光，观察吸附纳米颗粒的生物膜区域，通过EMCCD捕获目标区域的荧光亮点数目来表征吸附渗透过程。该方法可以检测到吸附在生物膜表面的纳米颗粒，具有操作简便，检测灵敏度高，结果表达直观等优势。

主权项

1.一种检测生物膜表面吸附纳米颗粒的方法，其特征在于该方法通过向细胞爬片上附着生长的生物膜中添加可发荧光的纳米颗粒，即纳米颗粒结合在生物膜表面，通过光线全反射后在大数值孔径物镜上产生的衰逝波激发纳米颗粒产生荧光，观察吸附纳米颗粒的生物膜区域，通过探测器光电倍增电荷耦合元件捕获目标区域的荧光亮点数目表征完整的纳米颗粒在生物膜表面的吸附渗透过程，具体操作按下列步骤进行：a、菌种来源与培养：选取睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosteroni, 保藏号：ATCC 11996，保藏单位：美国模式菌种收集中心，将睾丸酮丛毛单胞菌接种到营养肉汤培养基为蛋白胨10‰、牛肉膏1.5‰、酵母浸粉1.5 g/L、氯化钠5‰中，在温度20‑30℃，好养条件下，培养8‑15小时至稳定生长期；b、睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosteroni生物膜形成：将1‑4毫升在营养肉汤培养基中培养的吸光度值为0.6‑0.8的睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosteroni接种到24孔板中，再向孔板中加入细胞爬片，将24孔板置于温度25‑35℃细菌培养箱中静置培养0.5‑2小时后，轻轻取出孔板中的菌液，再取浓度为5‑20毫摩尔/升磷酸盐缓冲液2‑4毫升冲洗细胞孔板1‑3次，继续加入1‑4毫升新鲜的营养肉汤培养基，在温度25‑35℃培养箱中静置培养8‑24小时；c、生物膜吸附纳米颗粒的检测：将附着生物膜的细胞爬片倒扣在内含浓度为5‑20毫摩尔/升体积为20‑50微升的汉克斯平衡盐缓冲液的细胞培养皿中，加入浓度为10‑100毫克/升的荧光纳米颗粒20‑100微升，将样品置于样品台上，样品台用于承载置有倒扣生物膜爬片的细胞培养皿，将样品置于大数值孔径的全内反射专用物镜上，全内反射荧光显微镜的激光器产生激光光源聚焦到全内反射专用物镜后焦面并经过全内反射专用物镜边缘入射，全内反射专用物镜出射光为平行光并斜入射至盖玻片上，通过全内反射专用物镜产生的衰逝波激发纳米颗粒吸附在生物膜之后的荧光，探测器光电倍增电荷耦合元件捕获目标区域的荧光亮点数目表征完整的纳米颗粒在生物膜表面的吸附渗透过程，设置激光激发波长为405纳米，激光强度为2‑10%，探测器光电倍增电荷耦合元件温度为‑70℃，增益为200‑300，进行记录分析。