[发明专利]东方山羊豆赤霉素受体基因GoGID转化紫花苜蓿的方法

摘要

本发明公开了一种东方山羊豆赤霉素受体基因GoGID转化紫花苜蓿的方法。其具体步骤包括将GoGID基因插入到载体质粒DNA中；将插入有GoGID基因的载体导入到根癌农杆菌LBA4404中；农杆菌的培养；紫花苜蓿外植体的准备及转化；紫花苜蓿转基因植株鉴定、扩繁及评价。东方山羊豆赤霉素受体基因GoGID在紫花苜蓿中超表达后，转基因紫花苜蓿的株高增加了0.2‑0.35倍，生物量增加了14.9‑46.3％，紫花苜蓿的叶长叶宽也显著高于野生型，此外，开花时间比野生型晚一周，为解析牧草赤霉素信号途径提供理论基础，也为紫花苜蓿产量性状的遗传改良提供可能的候选基因和理论依据。

主权项

东方山羊豆赤霉素受体基因GoGID转化紫花苜蓿的方法,其特征在于：包括以下步骤：(1)将东方山羊豆赤霉素受体基因GoGID插入到PBI121载体质粒DNA中，得到PBI121重组载体：设计5’端包含XbaI酶切位点的上游引物P1和BamHI酶切位点的下游引物P2，如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；P1：5'‑GCTCTAGAATGGTGATCGAGAACGACATTGAG‑3'；P2：5'‑CGGGATCCTCAGTGATGGCCACGCCTAAGTGATG‑3'；其中，下划线部分为酶切位点；用该引物从东方山羊豆cDNA模板中扩增GoGID的全长阅读框，PBI载体和目的基因全长片段经XbaI和BamHI双酶切后回收产物，经T4DNA连接酶连接，得到插入有GoGID基因的PBI121载体，其含有CaMV35s启动子、GoGID基因以及一个卡那霉素抗性筛选标记；其中，所述东方山羊豆赤霉素受体基因GoGID如序列表中SEQ ID NO:3所示；(2)将所述PBI121重组载体导入到根癌农杆菌LBA4404中：A.向农杆菌LBA4404中加入PBI121重组载体质粒DNA，混匀，冰浴；B.于液氮中速冻，立即置于水浴中温育；C.加入YEB液体培养基，培养；D.菌体涂布于YEB选择平板上，培养两天；E.挑取单菌落，接种于YEB液体培养基中，培养过夜；提取导入有GoGID基因的农杆菌LBA4404的质粒并测序，结果显示导入基因的核苷酸序列与如序列表中SEQ ID NO:3所示的序列一致，则表明含有目的基因GoGID的表达载体构建成功；(3)导入有GoGID基因的农杆菌LBA4404的培养；(4)以紫花苜蓿单株为材料，生长于人工气候室中，取深绿色健康叶片，切成外植体；将外植体放在农杆菌重悬液中，然后放到无菌滤纸上，除去多余液体；在共培培养基上生长；把外植体取出，除菌；随后转入筛选培养基上；愈伤组织转入诱导培养基上；胚发育成小枝或根；小植株移入生根培养基继续培养；(5)紫花苜蓿转基因植株鉴定、扩繁及评价：将上述转化培养的植株，提取DNA，以nptⅡ基因引物P3、P4，GUS基因引物P5、P6进行检测；以引物P7、P8进行RNA转录水平检测，其中，P3～P8如序列表中SEQ ID NO:7～NO:12所示；挑选表达量较高转基因株系在大桶中生长，待长大后，通过扦插法获得拷贝和扩繁；用PBI121载体转化农杆菌LBA4404，获得重组农杆菌LBA4404，用重组农杆菌LBA4404转化得到转空载体的对照植株；转空载体的紫花苜蓿、转化插入有GoGID基因的PBI121载体的紫花苜蓿在人工气候室中成活后，分株，种于小盆；待健壮后，移于大盆，在温室中生长，期间精心管理，及时控制病虫害；观察表型，测定株高、鲜重、干重、叶茎比、开花期等指标。