[发明专利]人源脐带间充质干细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种人源脐带间充质干细胞的制备方法，包括脐带预处理和干细胞培养步骤，该方法简单、过程易于操作，在干细胞的培养过程，采用低氧的培养环境，干细胞培养基使用加有血清替代物和细胞因子IFN‑γ的无血清且不加入任何抗生素的培养基，可以有效促进干细胞增殖，从而有效的缩短培养时间，并能维持其表型特征，本发明的方法不仅提高了分离效率，缩短了培养周期，同时还获得了高纯度、安全性高、表征优良的脐带间充质干细胞。本发明适用于制备人源脐带间充质干细胞。

主权项

一种人源脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于按照如下的步骤顺序进行：（1）脐带预处理将人源脐带预处理，剥离华尔通氏胶，将其处理为1‑3mm3的组织块，用0.9%氯化钠洗涤组织块并离心，弃0.9%氯化钠上清；（2）干细胞培养①用移液管吸取上述离心后的组织块至培养瓶中，并使培养瓶中的组织块间隔1cm平铺于瓶壁；②将步骤①的培养瓶置于37℃、含有5%CO2和1%O2的培养箱中，培养30min后取出，将培养瓶外壁消毒后置于生物安全柜内，向培养瓶中按照每毫升组织块加入10‑15mL完全培养基，将培养瓶移至37℃、含有5%CO2和1%O2的培养箱，培养3‑4d换液一次；③当细胞生长融合度超过80%时，将培养瓶外壁消毒后置于生物安全柜内，向培养瓶加入0.25%胰蛋白酶消化液，均匀浸湿细胞壁表面，室温条件下作用3‑5min,待细胞从培养瓶壁脱落下来，向培养瓶中加入完全培养基终止消化；④用移液管轻轻吹打剩余贴壁细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管中，向培养瓶加入0.9%氯化钠吹洗2次，汇入离心管内，离心管于1100rpm离心5min，弃上清，用0.9%氯化钠合并沉淀至1管，取样计数，再次离心，弃上清；⑤向步骤④再次离心得到的细胞中加入完全培养基，形成重悬细胞，接种于培养瓶中，使细胞浓度为3×104‑5×104个/mL，将培养瓶置于37℃、含有5%CO2和1%O2的培养箱中，培养2‑3d;⑥当细胞生长融合度超过80%后，得到人源脐带间充质干细胞，收集第一代细胞；⑦重复上述①‑⑥步骤两次，分别收集第二代细胞和第三代细胞，将每代细胞冻存备用。