[发明专利]一种递送外源DNA进入总状毛霉未萌发孢子的方法

摘要

本发明公开了一种递送外源DNA进入总状毛霉未萌发孢子的方法，包括总状毛霉培养和孢子收集、总状毛霉孢子预处理以及使用HDEN法电击总状毛霉孢子三个步骤，得到导入待转化质粒的总状毛霉孢子。本发明用未萌发的孢子来作为导入外源分子的起始材料，并且应用HDEN电转化技术将外源DNA导入总状毛霉休眠孢子，可以省去做孢子萌发这一复杂的步骤，省去传统方法中制备原生质体或农杆菌转化的步骤等，并且转化率高，每个转化反应体系，至少可以达到不少于6000个阳性转化子的效果。

主权项

一种递送外源DNA进入总状毛霉未萌发孢子的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1）总状毛霉培养和孢子收集在固体琼脂培养基表面接种总状毛霉，培养至培养基表面长满总状毛霉孢子，洗下培养基表面的总状毛霉孢子，吸出孢子悬液并过滤去除菌丝，收集含有孢子的滤液，将滤液离心，收集沉淀的休眠孢子；2）总状毛霉孢子预处理用电击缓冲液重悬孢子，离心并收集孢子沉淀，重复上述重悬和离心步骤3‑4次后，将最后收集的孢子沉淀重悬于电击缓冲液中，得到孢子浓度为104‑1011个/ml的总状毛霉孢子悬液；所述电击缓冲液由终浓度为0.01‑100mmol/L的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸和终浓度为0.5‑5000mmol/L的甘露醇组成，电击缓冲液的pH为3.0‑9.5；3）使用HDEN法电击总状毛霉孢子在细胞培养板的孔中加入上述步骤得到的总状毛霉孢子悬液以及待转化质粒，混匀，得到孢子与质粒混合物，将细胞培养板置于冰上冰浴10‑15min，然后采用Etta Biotech X‑Porator H1电转仪进行HDEN法电击，将带有矩阵式电极的电击头插入孢子与质粒混合物内部，通电，使得孢子与质粒混合物内部产生电场，电击之后再将细胞培养板置于冰上冰浴10‑15min，然后将孢子和质粒混合物吸出，得到导入外源DNA的休眠的总状毛霉孢子；所述总状毛霉悬液与待转化质粒的比例为：6‑600000μl的总状毛霉孢子悬液：0.1‑10000μg的待转化质粒；所述电击参数如下：电压1‑6000V，脉宽2‑2000000ms，重复1‑100次，每次间隔5‑50000ms。