[发明专利]干细胞活性因子及其冻干粉剂

摘要

本发明涉及干细胞活性因子及其冻干粉剂。具体地说，本发明一方面涉及一种干细胞活性因子冻干粉剂，其中包括干细胞活性因子以及冻干保护剂，所述冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、壳聚糖、右旋糖苷、甘氨酸、精氨酸、氨基乙酸。进一步的，本发明还涉及制备所述干细胞活性因子冻干粉剂的制备方法。本发明方法具有如本发明说明书所述有益效果。

主权项

1.一种干细胞活性因子冻干粉剂，其中包括干细胞活性因子以及冻干保护剂；所述冻干保护剂选自海藻糖、甘露醇、壳聚糖、右旋糖苷、甘氨酸、精氨酸、氨基乙酸；该干细胞活性因子冻干粉剂是照包括如下步骤的方法制备得到的：(1)脐带源间充质干细胞获取：取健康足月剖宫产孕妇脐带，通过分离华通氏胶法，使用华通氏胶悬浮法制备；将华通氏胶放于T75培养瓶，加入适量间充质干细胞无血清培养基，置于37℃，5%的CO2培养箱内培养，培养7天以后出现细胞集落；10‑13天细胞达到饱和，进行传代；(2)细胞扩增：当细胞融合度达70‑80%时，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶细胞1‑2次，添加3‑5ml消化液，室温放置1‑2分钟，镜下观察细胞接近球形，轻轻拍打瓶壁，中止消化，转移至离心管混匀，取样计数，按照8000个细胞/cm2进行传代，2‑3天细胞密度达70‑80%时，反复以上操作，以获得足够量的间充质干细胞，采用P3‑P5代细胞制备；(3)细胞鉴定检测：细胞活率达90%以上时，流式检测标志物合格；(4)干细胞活性因子的制备：4i)细胞培养至最旺盛时，收集上清至离心管，0.22μm滤膜过滤上清除菌；4ii)用生理盐水清洗2‑3次培养瓶，弃去，然后采用细胞饥饿法加入10ml生理盐水/T225培养瓶继续培养12‑24小时，待细胞变圆，吹打混匀后移至离心管，采用超声破碎仪破碎细胞后离心1400rpm，离心5min，收集的上清，经0.22μm滤膜过滤除菌；其中所述生理盐水中添加了0.1~0.2mmol/L浓度的枸橼酸钠；4iii)将步骤4i)和4ii)的上清混合，采用截留分子量为10KD的纯化超滤系统浓缩，即得干细胞活性因子浓缩液；(5)冷冻干燥：5i)向步骤(4)所得干细胞活性因子浓缩液中添加冻干保护剂和醋酸钠，分装到西林瓶中，半加塞，置冷冻干燥机内；其中醋酸钠的量占浓缩液体积的重量/体积百分数为0.02~0.05%；5ii)开启冷冻干燥机，按预定冷冻干燥程序对样品进行冷冻干燥，压塞密封，即得冻干粉剂。