[发明专利]人成纤维细胞生长因子21重组蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种人成纤维细胞生长因子21重组蛋白及其制备方法和应用，将人成纤维细胞生长因子21重组蛋白编码基因的核苷酸序列与表达载体相连接得到重组表达载体；再将该重组表达载体转化宿主细胞，然后筛选高表达阳性宿主细胞，培养细胞并诱导表达人成纤维细胞生长因子21重组蛋白，收集菌体、破碎、离心、澄清、纯化，得到目标产物人成纤维细胞生长因子21重组蛋白。本发明还公开了该人成纤维细胞生长因子21重组蛋白在制备治疗代谢疾病药物中的应用。本发明的人成纤维细胞生长因子21重组蛋白（mFGF21）相比于野生型hFGF21蛋白，活性显著提高，能够更加有效降低糖尿病小鼠体内的血糖水平。

主权项

1.人成纤维细胞生长因子21重组蛋白在制备治疗II型糖尿病药物中的应用，其特征在于：该人成纤维细胞生长因子21重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述人成纤维细胞生长因子21重组蛋白的具体制备过程为：根据大肠杆菌密码子偏好性设计出人成纤维细胞生长因子21重组蛋白编码基因，该人成纤维细胞生长因子21重组蛋白编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，将合成的含有目的基因片段的载体和pET30a（+）分别用NdeI与Bam HI双酶切，酶切完毕后，胶回收各自需要的目标片段，使用T4 DNA连接酶将5种目的片段分别与原核表达载体pET30a（+）连接，连接反应体系为10µL，混匀，4℃连接过夜，然后各自转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，经过酶切鉴定后，即分别构建得到重组质粒pET30a‑mFGF21，将含有正确序列的重组质粒pET30a‑mFGF21转化至表达菌株Rosseta（DE3），转化后的单菌落分别接种至20mL含Kan 50µg/mL的LB培养基中，37℃培养8h，以体积比为1:100接种于另一20mL含Kan 50µg/mL的LB培养基中，37℃培养，当A₆₀₀在0.35时，加入IPTG至终浓度为0.25mmol/L进行诱导，诱导温度为30℃，5h后收获菌体，用Lysis buffer重悬菌体，该Lysis buffer的组成为：20mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、pH 8.0，破碎菌体后离心，然后澄清、纯化得到目标产物人成纤维细胞生长因子21重组蛋白；所述人成纤维细胞生长因子21重组蛋白在II型糖尿病上的长效降糖效果明显优于野生型hFGF21，其作用持续时间长，且该人成纤维细胞生长因子21重组蛋白能够显著降低II型糖尿病的TG含量，使得II型糖尿病的血脂水平上表现出更佳的改善效果。