[发明专利]一种利用人微血管内表皮细胞检测凉茶抗炎活性的方法

摘要

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种利用人微血管内表皮细胞检测凉茶抗炎活性的方法，其特征在于，将生长状态良好的HMEC‑1细胞接种在24孔细胞培养板板中，待HMEC‑1细胞长至单层，用待测凉茶检测液与所述的细胞预先孵育3h，然后再用1g/ml内毒素(LPS)处理HMEC‑1细胞，激发细胞炎症反应，最后通过荧光定量PCR的方法检测细胞粘附因子ICAM‑1基因的表达量。具有抗炎活性的凉茶检测液预孵育细胞后，细胞ICAM‑1的表达量受到抑制，对其的抑制能力的检测可以作为衡量凉茶检测液抗炎效果的指标。

主权项

1.一种利用人微血管内表皮细胞检测凉茶抗炎活性的方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)凉茶检测液的配制：以mg/L计:(1)以干燥的植物原料计，称取鸡蛋花9g，金银花6.5g，菊花10g，布渣叶20g，甘草20g，夏枯草10g，分别用200倍重量的水浸泡30min，插上电煎药壶在100℃下煎煮1h，85-95℃下煎煮1h，重复前述方法煎煮一次，分别用定性滤纸过滤，合并两次滤液，减压抽滤后，收集滤液。市售凉茶检测液则需要定性滤纸过滤，收集滤液；(2)将步骤(1)中得到的滤液，分别在-0.1MPa，65℃下旋转蒸发浓缩成浸膏，取出浸膏，于-20℃下冻结，再用真空冷冻干燥机处理冻结后的浸膏，得到凉茶粉末，保存于-20℃下；(3)称取步骤(2)所得的凉茶粉末100mg/样本，用10ml的MCDB131原始培养基溶解，配成10mg/ml的凉茶母液，用0.22μm无菌滤膜过滤后分装，于-20℃保存备用，保存时间不超过14d；(4)配制1mg/ml的脂多糖(LPS)溶液作为人微血管内表皮细胞的诱导剂，配制1mM的雷公藤红素溶液，作为阳性对照药物，于-20℃下保存备用；(5)将生长状态良好的人微血管内表皮细胞，用细胞计数板计数后，接入24孔细胞培养板的孔中，所述的细胞培养板的孔中包含有10％的胎牛血清，1μg/ml的氢化可的松和10ng/ml的重组人表皮生长因子的MCDB131完全培养基，在37℃，5％CO2条件下培养HMEC-1细胞；(6)待人微血管内表皮细胞长至单层，更换如步骤(5)所述的MCDB131完全培养基的新鲜培养基，然后将步骤(3)中配好的凉茶母液稀释至0.1mg/ml～0.4mg/ml检测浓度；将步骤(4)中配好的雷公藤红素溶液稀释至1μM，于37℃孵育细胞3h；然后向所述的细胞培养板的每孔中再加入终浓度为1μg/ml的LPS，继续孵育细胞3h；孵育结束后，弃掉所述的培养基，每孔加入细胞裂解液TRIzol 200ul，在室温下静置10min，收集细胞裂解液TRIzol到无RNA酶的离心管中；每管加入40μl的氯仿，上下颠倒使之充分混匀，室温下静置10min，4℃下于12000g离心15min；离心结束后，收集上清水相液到新的离心管中，并加入200μl的异丙醇沉淀RNA，然后一并转入RNA吸附柱中，在室温下静置10min，于8000g离心1min，然后用500ul75％乙醇洗两次，每管加入30ul DEPC水，于65℃孵育5min，在4℃，1200rpm下离心30s收集得到总RNA；(7)将步骤(6)收集得到的总RNA通过微型分光光度计检测吸光度A260/A280为2.0，通过琼脂糖凝胶电泳得到RNA完整无降解且清晰的两条带；(8)取500ng步骤(6)所得的总RNA置于PCR仪上，在37℃5min去除残留的基因组DNA；用反转录试剂盒合成得到cDNA第一条链；从qPrimerDepot引物库中搜索得到检索号为NM_010493细胞间粘附因子ICAM-1基因的引物和检索号为NM_002046的内参基因GAPDH的引物，所述引物的序列如下所示：扩增ICAM-1基因的引物对：f-ICAM-1上游引物：CCTTCCTCACCGTGTACTGG，r-ICAM-1下游引物：AGCGTAGGGTAAGGTTCTTGC；扩增GAPDH内参基因的引物对：f-GAPDH上游引物：TGACAACAGCCTCAAGAT，r-GAPDH下游引物：GAGTCCTTCCACGATACC；(9)进行荧光定量PCR；(10)以GAPDH基因为内参基因，计算ICAM-1基因的相对表达量。