[发明专利]一种人全血冻存样本RNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种人全血冻存样本RNA的提取方法，其方法为：步骤一、人血的处理：(1)、用紫帽采血管取血液标本；(2)、使用通用台式离心机离心；(3)、标记1.5ml无RNA酶管；(4)、至均质状；(5)、继续下面的步骤；步骤二、提取RNA：(1)、样本先解冻；(2)、加入氯仿；(3)、离心；(4)、标号；(5)、离心；(6)、完全除去上清；(7)、用冷冻微量离心机下离心；(8)、倒上清液；(9)、干燥；(10)、小管分装；(11)、测定RNA浓度；(12)、RNA样品的保存；(13)、测定RNA质量。有益效果：为医学研究、临床诊断治疗研究提供方法。

主权项

一种人全血冻存样本RNA的提取方法，其特征在于：其方法如下所述：步骤一、人血的处理：(1)、用紫帽采血管取血液标本，采6ml，每次RNA提取0.1ml血细胞；(2)、使用通用台式离心机离心，在3000rpm离心条件下离心10分钟，离心后上层为淡黄色血浆，下层为全血细胞；(3)、标记1.5ml无RNA酶管，P代表血浆，B代表全血细胞，此外管上标记样本号、日期，以无菌无RNA酶枪头小心地将血浆、全血细胞分别装入EP管；(4)、取全血细胞0.1ml，加入Trizol 1ml，用于裂解细胞，保护RNA，使用振荡器充分振荡，振荡20秒，用枪吹吸5次，至均质状；(5)、血液标本处理完成后，继续下面的步骤，或者将样本放入‑80℃冰箱保存；步骤二、从血液细胞提取RNA：(1)、全血细胞和Trizol的混合物，冻存样本先解冻，室温静止孵育5分钟；(2)、每管加入0.2ml的氯仿，1ml Trizol加入0.2ml氯仿，用手振荡15秒，之后室温静置3分钟；(3)、用冷冻微量离心机，在12000g离心条件下离心15分钟；(4)、在1.5ml无RNA酶的EP新管上标号，将(3)中离心后倾斜45度上层透明部分全部转入新管，加入异丙醇0.5ml，1ml Trizol对应用量0.5ml异丙醇，振荡，室温静置10分钟；(5)、用冷冻微量离心机，在4℃、12000g离心条件下离心10分钟；(6)、RNA沉于管低，完全除去上清，加入75％乙醇1ml，0.75ml无水乙醇加0.25ml DEPC处理水，温和地上下翻转；(7)、用冷冻微量离心机，在4℃、7500g离心条件下离心5分钟；(8)、倒上清液，在RNA沉淀对侧倒液，别倒掉RNA pellet，用枪头取出尽可能多的乙醇；(9)、干燥，空气中3分钟晾干；(10)、根据RNA沉淀大小加入去核糖核酸酶水20‑40ul，用枪吹打数次，55度温度条件孵育10分钟，溶解RNA，最后小管分装；(11)、使用酶标仪，测定RNA浓度，上样量为2微升，RNA浓度：(A260‑A320)×稀释倍数×40μg/ml，A260/A280：1.8‑2.1可以满足要求，>2.1可能说明RNA降解，<1.6可能说明有蛋白杂质；(12)、RNA样品的保存：可以‑80℃保存或继续下一步；(13)、使用Agilent 2100生物分析仪和RNA 6000Nano分析试剂盒测定RNA质量，按说明书操作，上样量1微升，检测核糖体18S和28S的强度，RIN值越接近于10说明RNA完整性越好。