[发明专利]一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用有效
| 申请号： | 201610824257.8 | 申请日： | 2016-09-14 |
| 公开（公告）号： | CN106399356B | 公开（公告）日： | 2019-09-24 |
| 发明（设计）人： | 言普;庹德财;付兰兰;沈文涛;周鹏 | 申请（专利权）人： | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/66 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 郝传鑫;陈欢 |
| 地址： | 571101 *** | 国省代码： | 海南;46 |
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| 摘要： | 本发明提供一种病毒侵染性克隆的构建方法及其应用。本发明提供方法包括如下步骤：整个或分段扩增病毒基因组，表达载体线性化处理，基因组两端或各基因片段与表达载体两端分别设计有用于体外拼接的重叠序列；病毒基因组或各基因片段与线性化表达载体进行体外拼接；拼接产物直接转化农杆菌，获得含有病毒侵染性克隆的重组农杆菌。重组农杆菌用于接种，获得病毒的系统性侵染。本发明的创新点在于将病毒基因组与表达载体通过体外核酸拼接后，不转化大肠杆菌，而是转化农杆菌，获得在农杆菌中稳定的病毒侵染性克隆，避免了病毒在大肠杆菌中产生的毒性或不稳定现象，构建方法更为灵活和简便。 | ||
| 搜索关键词： | 病毒侵染性 病毒基因组 表达载体 农杆菌 克隆 构建 体外 拼接 大肠杆菌 重组农杆菌 基因片段 线性化表达载体 病毒 线性化处理 拼接产物 稳定现象 直接转化 重叠序列 基因组 核酸 扩增 侵染 转化 分段 接种 应用 灵活 | ||
【主权项】：
1.一种病毒侵染性克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)、通过PCR整体或分段扩增病毒基因组，所得基因组两端或各基因片段两端设计有用于体外拼接反应的接头序列；通过PCR扩增或酶切使表达载体线性化；所得线性化的表达载体两端设计有用于体外拼接反应的重叠序列；2)、通过Gibson拼接或In‑Fusion拼接方法使病毒基因组或各基因片段与线性化表达载体进行体外拼接；3)、拼接产物直接转化农杆菌，获得含有病毒侵染性克隆的重组农杆菌。
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