[发明专利]利用亚甲基蓝与G-四链体的结合进行电化学检测端粒酶活性的方法

摘要

本发明公开一种利用亚甲基蓝与G‑四链体的结合进行电化学检测端粒酶活性的方法，本方法步骤如下：首先，在含有端粒酶引物的溶液中加入端粒酶进行扩增并形成G‑四链体；然后，加入亚甲基蓝使其与G‑四链体部分结合；最后，利用电化学工作站对溶液中的亚甲基蓝进行DPV检测。本发明无需昂贵的标记DNA以及进行复杂的电极修饰，可避免标记DNA探针及修饰电极而导致的成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高、准确性好等优点。

主权项

1.一种利用亚甲基蓝与G‑四链体的结合进行电化学检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）细胞的培养以及端粒酶的提取得到裂解后的细胞溶液；所述细胞为HeLa细胞；所述HeLa细胞在端粒酶缓冲溶液中的数量为10~10000个细胞；2）在含有端粒酶引物的缓冲溶液中加入裂解后的细胞溶液进行扩增得到重复的富G序列，在钾离子的存在下得到含有G‑四链体的扩增溶液；在45 μL含有0.1 ~ 2 μM端粒酶引物的端粒酶缓冲溶液中加入5 μL细胞中提取的端粒酶，在30 ~ 37℃下进行扩增反应1 ~4小时，并在钾离子的存在下形成G‑四链体的扩增溶液；所述缓冲溶液为含有MgCl₂、KCl、Tween 20、EGTA和dNTPs的pH =8.3的20 mM Tris‑HCl溶液，所述MgCl₂初始浓度为1.5 mM，KCl初始浓度为63 mM，Tween 20初始浓度为0.005%(v/v)，EGTA初始浓度为1 mM，dNTPs初始浓度为1 ~ 2 mM；3）在含有G‑四链体的扩增溶液中加入亚甲基蓝使其与G‑四链体结合得到溶液；所述亚甲基蓝的加入量为50 μL，浓度为1 ~ 10 mM；4）利用差分脉冲伏安法对溶液中的亚甲基蓝进行检测，所述差分脉冲伏安法的步骤是通过三电极体系进行检测，具体步骤如下：首先，将ITO电极依次浸泡在丙酮，乙醇和超纯水中，并分别超声15~20分钟进行清洗；之后，将清洗后的ITO电极浸泡在1 mM NaOH中进行修饰；4~6小时后，将完成修饰的ITO电极放入超纯水中超声清洗15~20分钟，得到了表面带有负电荷的ITO工作电极；然后将表面带有负电荷的ITO工作电极放入电解池下半部分的凹槽内，之后，将带有直径为6 mm孔的电解池上半部分固定在工作电极上方，在他们之间放入O型密封圈防止漏液，在直径为6 mm的孔中加入步骤3）得到的溶液，将一根铂丝作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极插入溶液中，与工作电极形成三电极体系并通过DPV法进行电化学检测。