[发明专利]一种口含烟浸提物体外细胞毒性测试方法

摘要

一种口含烟浸提物体外细胞毒性测试方法，包括以下步骤：1）口含烟浸提物的制备；2）细胞接种培养；3）口含烟浸提物染毒；4）CCK‑8染色试验；5）结果与分析。本发明的特点在于：首次建立了口含烟的体外细胞毒性测试，且在进行测试时，减少了多次洗涤细胞的步骤，使得实验过程更加简便；CCK‑8试剂可在染毒后直接加入细胞培养基，无需换液步骤，产生的水溶性甲臜产物可直接进行吸光值检测，减少了检测前的溶解步骤，缩短了实验周期和时间；且可实现连续多次的吸光值检测，无需增加额外的实验步骤，为寻找合适的检测时间点提供了方便；CCK‑8试剂本身对细胞毒性小，避免了本底的影响和实验误差，测试结果重复性好、稳定性强、灵敏度高。

主权项

一种口含烟浸提物体外细胞毒性测试方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）口含烟浸提物的制备：分别将口含烟样品处理后用二甲基亚砜（DMSO）或去离子水进行浸提，于37 ℃震荡24±3 h后，1800 g离心30‑60 min，吸取上清转移至新离心管中，25000 g离心30‑60 min，吸取上清经无菌过滤器过滤后‑80℃保存，即可获得口含烟样品的DMSO浸提物或水溶性浸提物储存液；细胞接种培养：经扩增培养的中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）或人支气管上皮细胞（BEAS‑2B细胞）进行消化以后，制备细胞悬液1×10⁵个/mL，将细胞接种至96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，于37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h；口含烟浸提物染毒：使用细胞培养基将口含烟样品浸提物储存液调整到不同浓度，设置5个非零浓度；细胞培养24 h后，吸去培养基，96孔板除最外周36孔之外每孔加入100 μL的含有阴性对照、样品浸提物或阳性对照的细胞培养基，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100 μL细胞培养基作为空白对照，于37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h；空白对照：细胞培养基，孔内无细胞；阴性对照：口含烟DMSO浸提物染毒试验的阴性对照为含有与最高剂量组的DMSO浓度一样的DMSO细胞培养基；口含烟水溶性浸提物染毒试验的阴性对照为细胞培养基；阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS），浓度100‑200 μg/mL；CCK‑8染色试验：结果与分析：样品浸提物孔吸光值：At阴性对照孔吸光值：Ac空白对照组吸光值：Ab细胞存活率C（%）=×100%公式中的分母表示的是平均值：吸光值的平均值。