[发明专利]一种用于水体净化的复合微生物菌剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种用于水体净化的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：应用plackett‑burman（PB）实验确定已筛选并且无拮抗作用的2株细菌和3株酵母菌中对生活污水中总磷起到显著降解作用的菌株；将降解污水中总磷的优势菌株作为显著性因素设置不同步长进行最陡爬坡实验以确定污水中总磷的最佳降解率；最后采用中心复合实验方法以总磷降解率作为响应值，以最陡爬坡实验中总磷降解最佳效果对应的优势菌株种子液体积为中心点进行响应面分析得到预测的污水中总磷最佳降解率，由回归模型得到混合菌株间最佳复配。

主权项

一种用于水体净化的复合微生物菌剂的制备方法，步骤如下：（1）菌种活化：将在4℃温度下斜面保存的1447酵母菌（CGMCC NO.2.3889）、枸杞酵母菌（CGMCC NO.2.3854）、酒精酵母菌（CGMCC NO.2.3868）、枯草芽孢杆菌（CGMCC NO.1.2172）、巨大芽孢杆菌（CGMCC NO.1.2927）活化，将其分别划线于相应固体培养基上，其中酵母菌于28℃培养2天，细菌于37℃培养1天；（2）种子液制备：挑取活化的菌落，分别以1%接种量接种到各自液体培养基中，酵母菌于28℃、180rpm培养2天，细菌于37℃、220rpm培养1天；所述种子培养基组成为：酵母菌培养基为YEPD培养基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.0，121℃灭菌20min；细菌培养基为肉汤培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.2‑7.4，121℃灭菌20min；（3）菌种筛选取处于生长至对数中期的五种菌体的种子液稀释后调整为OD600为0.9，以五种菌体种子液添加量作为影响污水中总磷降解效果的因素，用minitab软件中的分析因子设计对实验结果进行分析，选用实验次数为N=20次的实验方法进行PB实验设计，设计两个空白作为误差分析项，对于每个菌体分别选取高水平（1）和低水平（‑1），其中高水平的含义为向100mL污水中添加1.5mL种子液，低水平的含义为向100mL污水中添加1mL种子液，以污水中总磷降解率作为响应值，单因素T检验（显著性差别检验）结果表明1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢杆菌的p值小于0.05（置信限度为95%），由此确定1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢杆菌为影响污水中总磷降解的显著性菌株；（4）菌种复合选取1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢杆菌作为降解污水中总磷的显著性因素进行最陡爬坡实验，三株显著性菌株对于污水中总磷降解显示为正效应，因此对于1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢杆菌分别选择以3mL、2mL、1mL种子液体积作为变化的步长，酒精酵母和枯草芽孢杆菌选择平均水平1.5mL进行最陡爬坡实验以找出使污水中总磷降解率能够达到最佳水平的组合即中心点，1447酵母菌11mL、枸杞酵母9mL、酒精酵母1.5mL、巨大芽孢杆菌5mL、枯草芽孢杆菌1.5mL；运用minitab软件分析程序对20组实验的响应值进行回归分析；经过回归方程拟合，因素1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢杆菌、酒精酵母和枯草芽孢杆菌对污水中总磷降解率的影响可以用函数式表示：Y=93.095+1.082X₁+1.668X₂+1.15X₃‑3.288X₁²‑2.419X₂²‑4.824X₃²+0.719X₁X₂‑2.994X₁X₃+2.375X₂X₃；模型只显示显著性因素对总磷降解率的影响，不考虑非显著性因素对于污水中总磷的降解效果，PB实验已经验证显著性因素；其中Y代表污水中总磷的降解率；X₁，X₂，X₃分别代表1447酵母菌种子液体积，枸杞酵母种子液体积，巨大芽孢杆菌种子液体积；用minitab软件拟合回归模型，拟合模型结果显示调整系数R²=0.9768，说明模型可以解释实验所得的污水中总磷降解率的变化，方程拟合较好，实验结果可信；回归模型分别对X₁，X₂，X₃进行求导解方程，得出实际所加1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢杆菌种子液体积分别为11mL、9mL、5mL；（4）验证试验：进行验证污水处理实验，实验得出的总磷降解率的平均值与模型预测数值接近，说明模型能够反应出筛选出的菌株对于污水中总磷降解率的影响，用此方法确定出的最佳菌株组成具有可行性，最终确定用于污水处理的复合菌株配比为：1447酵母菌11mL、枸杞酵母9mL、酒精酵母1.5mL、巨大芽孢杆菌5mL、枯草芽孢杆菌1.5mL，总磷降解率为93.2%，处理后污水中总磷含量为4.5g/l，达到污水排放三级标准。