[发明专利]一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法

摘要

本发明涉及一种适用于制浆过程的地衣芽孢杆菌工程菌及其构建方法。所述低产纤维素酶地衣芽孢杆菌，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；所述celB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及该低产纤维素酶地衣芽孢杆菌的构建方法。本发明构建的低产纤维素酶地衣芽孢杆菌菌株，既克服了纤维素酶过高表达引起纸浆纤维的破坏，同时一定程度低产的纤维素酶能够保障半纤维素酶和木质素酶纸浆处理效果的发挥，具有广泛的应用前景。

主权项

1.一种地衣芽孢杆菌工程菌在造纸制浆过程中的应用， 所述地衣芽孢杆菌工程菌为将地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）中的编码内切纤维素酶基因celB失活后获得；所述celB基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述地衣芽孢杆菌工程菌的构建方法包括如下步骤：（1）提取地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）20085菌体的DNA，以DNA为模板，使用引物F₁和R₁进行PCR扩增，得到用于celB基因敲除的同源臂celB1；所述的PCR引物序列如下：F1: CGGGATCCCGCTTCTAAAACACCCGTTGR1: AAGGCCAGCAAAAGTACATGACATTGCCGTCT（2）提取穿梭质粒PHT01的DNA，以DNA为模板，进行PCR扩增，得到Cm^r片段；所述的PCR引物序列如下：F₂: ATGTCATGTACTTTTGCTGGCCTTTTGCTCAR₂: CATAATCGGCTGGATCCTAGTGACTGGCGATGCT（3）将步骤（i）制得的celB1片段与步骤（ii）制得的Cm^r片段进行重叠PCR，制得celB1‑Cm^r片段；（4）将敲除载体用限制性内切酶BamH I酶切，并利用电转化仪转化至地衣芽孢杆菌感受态细胞，经复苏后，涂在含氯霉素的培养基上，在35～38℃培养1～2天，筛选具有氯霉素抗性的转化子，制得低产纤维素酶地衣芽孢杆菌；所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）20085来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CICC 20085。