[发明专利]一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用

摘要

本发明公开了一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用，以孔径适配的介孔材料SBA15为载体，并在适宜的pH条件下，固定游离的山梨醇脱氢酶得到山梨醇脱氢酶的固定化酶；以制备得到的固定化山梨醇脱氢酶为催化剂，在1.5~100 g/L的底物(山梨醇或D‑半乳糖醇或L‑艾杜糖醇)浓度下，添加20 U~300 U的NADH氧化酶和0.05~0.5 mmol/L的NAD+，在pH 8.0~9.0，20~30℃、180~280 rpm条件下反应3~12 h，得到D‑果糖(或D‑塔格糖或L‑山梨糖)，反应结束后过滤回收山梨醇脱氢酶可重复使用5次仍保留75%的催化活性。本发明中通过计算机模拟进行固定化条件优化，固定化效率高，蛋白固载量达到545 mg/g。

主权项

一种固定化山梨醇脱氢酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）山梨醇脱氢酶体积预测：采用在线工具swiss‑model，并以PDB:1K2W为模板，对山梨醇脱氢酶进行3D结构同源建模，并预测其体积大小；2）固定化pH范围预测：山梨醇脱氢酶3D结构提交在线服务器 PDB2PQR，对其在不同pH环境条件下的表面电势进行分析，并预测合适的固定化pH范围；3）SBA15介孔材料的吸附：用醋酸钠缓冲溶液配制2~4 mg/mL适配孔径的介孔材料溶液，超声，磁力搅拌，获得均匀分散的介孔材料溶液，向其中加入游离的山梨醇脱氢酶，终浓度1~2 mg/mL，室温下搅拌或者低速震荡吸附0.25~6 h，取出过滤，并用醋酸钠缓冲溶液冲洗，得到固定化山梨醇脱氢酶，置于4℃下保存。