[发明专利]一种细胞内ATP的圆二色光谱实时检测方法

摘要

一种细胞内ATP的圆二色光谱实时检测方法，属于材料化学技术领域。本发明包括ATP适配体ATP aptamer序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器，ATP错配mismatch DNA序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器，两种大小金二聚体修饰穿膜肽，两种大小金二聚体传感器在细胞内圆二色信号随时间的变化，基于大小金二聚体的圆二色信号实现胞内ATP实时检测，建立标准曲线等步骤实现。本发明提供了能够通过圆二色信号实时检测胞内ATP含量的方法，制备出了圆二色性能高，生物相容性好的金纳米粒子二聚体。

主权项

一种细胞内ATP的圆二色光谱实时检测方法，其特征在于步骤为：（1）ATP 适配体序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬后修饰巯基ATP aptamer序列；15nm金纳米粒子GNP修饰与适配体部分互补的巯基ATP CS1序列；将得到的GNP‑aptamer及GNP‑ CS1复合体混匀，得到ATP适配体序列组装的圆二色大小金二聚体aptamer‑dimer；（2）ATP错配序列组装构建的圆二色大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬后修饰巯基mismatch DNA序列；15nm金纳米粒子GNP修饰与ATP错配序列部分互补的巯基ATP CS2序列；将得到的GNP‑mismatch及GNP‑ CS2复合体混匀，得到ATP错配序列组装的圆二色大小金二聚体mismatch‑dimer；（3）两种大小金二聚体修饰穿膜肽：将步骤（1）及（2）得到大小金二聚体分别与SH‑PEG‑5000和穿膜肽TAT混匀，偶联12h，分别得到表面修饰有穿膜肽的圆二色性TAT‑aptamer‑dimer及 TAT‑mismatch‑dimer；（4）两种大小金二聚体传感器在细胞内圆二色信号随时间的变化：分别将步骤（3）得到两种穿膜肽修饰的圆二色大小金二聚体与一定数量的细胞共同培养不同时间点后，用胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有不同量的圆二色aptamer‑dimer及 mismatch‑dimer的细胞悬液；将细胞悬液进行圆二色性表征，记录不同时间点的圆二色信号，绘制散点图，得到胞内最佳检测时间；（5）基于大小金二聚体的圆二色信号实现胞内ATP实时检测：将步骤（3）得到穿膜肽修饰的圆二色性TAT‑aptamer‑dimer与添加不同抑制剂和促进剂的细胞及未处理的细胞分别共同孵育，当存在待测物ATP时，组装体逐渐解散，导致圆二色信号的变化，进而进行检测，建立胞内ATP浓度与圆二色光谱的标准曲线。