[发明专利]一种基于手性自组装纳米传感器实现胞内端粒酶活性检测的方法

摘要

一种基于手性自组装纳米传感器实现胞内端粒酶活性检测的方法，属于材料化学技术领域。本发明包括端粒酶引物TE primer序列组装构建的手性大小金二聚体传感器，端粒酶引物错配TE mismatch序列组装构建的手性大小金二聚体传感器，两种大小金二聚体修饰穿膜肽，两种大小金二聚体传感器在细胞内手性信号随时间的变化，基于大小金二聚体的手性信号实现胞内端粒酶活性的检测，建立标准曲线等步骤实现。本发明提供了能够通过手性信号检测胞内端粒酶活性的方法，制备出了手性产率高，细胞中分散性好的金纳米粒子二聚体。

主权项

1.一种用于实现胞内端粒酶活性检测的手性自组装纳米传感器的构建方法，其特征在于步骤为：（1）端粒酶引物序列组装构建的手性大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬后修饰巯基TE primer序列；15nm金纳米粒子GNP修饰与linker DNA部分互补的巯基TE CS1序列；将得到的GNP‑primer及GNP‑ CS1复合体混匀，通过linker DNA1组装得到适配体序列组装的手性大小金二聚体primer‑dimer；SEQ ID NO. 1：TE primer：5’‑TTTTTTAATC CGTCGAGCAG AGTT’‑3’；SEQ ID NO. 2：TE CS1：5’‑ATAGGTATAT TTTTT’‑3’ ；SEQ ID NO. 3：Linker DNA1：5’‑CCCT AACTAA CCAACTCTGC TCGACGGATT’‑3’ ；（2）端粒酶引物错配序列组装构建的手性大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬后修饰巯基TE mismatch序列；15nm金纳米粒子GNP修饰与linker DNA部分互补的巯基TE CS2序列；将得到的GNP‑mismatch及GNP‑CS2复合体混匀，通过linker DNA2组装得到错配序列组装的手性大小金二聚体mismatch‑dimer；SEQ ID NO. 4：TE mismatch：5’‑TTTTTTTATC CGTAGAGCAG CGTC’‑3’ ；SEQ ID NO. 5：TE CS2：5’‑ATAGGTATAT TTTTT’‑3’ ；SEQ ID NO. 6：Linker DNA2：5’‑CCCTAACCCT AAGACGCTGC TCTACGGATA’‑3’ ；（3）两种大小金二聚体修饰穿膜肽：将步骤（1）及（2）所得大小金二聚体分别与SH‑PEG‑5000和穿膜肽TAT混匀，偶联12h分别得到表面修饰有穿膜肽的手性大小金二聚体TAT‑primer‑dimer及 TAT‑mismatch‑dimer；SEQ ID NO. 7：TAT：5’‑YGRKKRRQRR RC’‑3’；（4）两种大小金二聚体传感器在细胞内手性信号随时间的变化：分别将步骤（3）得到的两种穿膜肽修饰的手性大小金二聚体与一定数量的细胞共同培养不同时间点后，用胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有不同量的手性primer‑dimer及 mismatch‑dimer的细胞悬液；将细胞悬液进行圆二色性表征，记录不同时间点的手性信号，绘制散点图，得到胞内最佳检测时间；上述方案的具体步骤如下：（1）端粒酶引物序列组装构建的手性大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中，取100μL 2nM 25nm金纳米粒子将其与巯基TE primer序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀；15nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中，取100μL 2nM 15nm金纳米粒子与适配体部分互补的巯基TE CS1序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀，分别加入终浓度为50mM的NaCl溶液，充分混合后，室温孵育过夜后，离心3次除去溶液中未反应的DNA，分别重悬于100μL的5mM PB缓冲液中；取100μL GNP‑primer及50μL GNP‑CS1复合体混匀，加入5μL 10μM linker DNA1组装得到端粒酶引物序列组装的手性大小金二聚体primer‑dimer，再加入终浓度为50mM NaCl溶液进行老化，室温下孵育12h，再将组装体通过梯度离心纯化；（2）端粒酶引物错配序列组装构建的手性大小金二聚体传感器：柠檬酸还原法合成的25nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中，取100μL 2nM 25nm金纳米粒子将其与巯基TE mismatch序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀；柠檬酸还原法合成的15nm金纳米粒子GNP离心重悬于5mM pH 7.4的PB缓冲液中，取100μL 2nM 15nm金纳米粒子与适配体部分互补的巯基TE CS2序列以摩尔浓度1︰5的比例混匀，分别加入终浓度为50 mM的NaCl溶液，充分混合后，室温孵育过夜后，离心3次除去溶液中未反应的DNA，分别重悬于100μL的5mM PB缓冲液中；取100μL GNP‑mismatch及50μL GNP‑CS2复合体混匀，加入5μL 10μM linker DNA2组装得到端粒酶引物错配序列组装的手性大小金二聚体mismatch‑dimer，再加入终浓度为50mM的NaCl溶液进行老化，室温下孵育12 h，再将组装体通过梯度离心纯化；（3）两种大小金二聚体修饰穿膜肽：将步骤（1）及（2）得到大小金二聚体分别与SH‑PEG5000和穿膜肽TAT以1︰1000︰100的摩尔浓度混匀，室温孵育12h后，7500rpm离心20min，去除上清液，沉淀重悬于细胞培养液中，得到稳定的表面修饰有穿膜肽的手性TAT‑primer‑dimer及 TAT‑mismatch‑dimer；（4）两种大小金二聚体传感器在细胞内手性信号随时间的变化：将细胞接种于24孔培养板中，使每孔中的细胞数量为10⁴个，培养24h后去掉培养液，取8个孔加入终浓度为5nM的穿膜肽修饰的手性TAT‑primer‑dimer分别与10⁴个细胞共同培养0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h；取8个孔加入终浓度为5nM的穿膜肽修饰的手性TAT‑mismatch‑dimer分别与10⁴个细胞共同培养0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、24h；之后分别用胰蛋白酶消化细胞，分别得到细胞内含有不同量的手性primer‑dimer及 mismatch‑dimer的细胞悬液；将细胞悬液进行圆二色性表征，记录不同时间点的手性信号，绘制散点图，得到胞内最佳检测时间。