[发明专利]一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法

摘要

本发明属于生理学领域，具体涉及到生命体內肌红蛋白的还原过程，模拟体液环境下肌红蛋白与氧气的结合与分离，以及蛋白活性中心铁卟啉的结构的变化和电子转移的过程。本发明采用激光闪光光解、紫外‑可见、圆二色等多种光谱的方法研究肌红蛋白活性中心位点铁卟啉铁的价态和配位状态的变化。本发明的有益效果：本发明利用激光闪光光解技术研究氨基酸对肌红蛋白瞬态吸收以及其动力学过程的影响，发现游离氨基酸可以发挥与蛋白质中氨基酸不同的作用，对光激发肌红蛋白弛豫过程影响较大。这具有重要的生理学和医学意义，为光动力学治疗肌肉和血液疾病提供了新的可能，并且还可能为肉类产品的保鲜技术的发展提供新的思路。

主权项

1.一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法，其特征在于，包括以下步骤：一、不同形态的肌红蛋白的制备与光谱数据的测定，包括的步骤：(1)配制0.2mol/L的PH＝7.4的Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲溶液作为储备液，并于4℃的冰箱中避光保存，待用时稀释到0.05mol/L；(2)用配好的0.05mol/L的Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲溶液配制10‑4mol/L的pH＝7.4的高铁肌红蛋白作为储备液，并于4℃的冰箱中避光保存，待用时再稀释到10‑5mol/L；(3)用配好的Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲溶液将高铁肌红蛋白稀释成浓度为10‑5mol/L的高铁肌红蛋白溶液，取2ml高铁肌红蛋白溶液于比色皿中，测其紫外‑可见光谱，再向其中加入10μl、浓度为0.1mol/L的K3Fe(CN)6，直至达到高铁肌红蛋白溶液：K3Fe(CN)6的摩尔比为1：100，待其完全反应后，再测定其紫外‑可见光谱；(4)亚铁肌红蛋白制备是利用将2ml浓度为10‑5mol/L的高铁肌红蛋白溶液进行还原，高铁肌红蛋白溶液中加入8μl、浓度为0.1mol·L‑1的Na2S2O4溶液，直至达到高铁肌红蛋白溶液：Na2S2O4的摩尔比达到1：40，将高铁肌红蛋白还原后，透析除去Na2S2O4制得；(5)氧合肌红蛋白制备是利用将2ml浓度为10‑5mol/L的高铁肌红蛋白溶液进行还原，高铁肌红蛋白溶液中加入8μl、浓度为0.1mol·L‑1的Na2S2O4溶液，直至达到高铁肌红蛋白溶液：Na2S2O4的摩尔比达到1：40，将高铁肌红蛋白还原后，通入过量的高纯氧气并透析除去Na2S2O4制得；(6)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的紫外‑可见光谱的测定，测定条件为狭缝宽度为2nm，扫描波长范围220～700nm，扫描速率200nm·min‑1，响应时间中等，再向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中分别加入0.01mol/L的游离色氨酸，达到摩尔比为高铁肌红蛋白：游离色氨酸＝1：1，分别测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白的紫外‑可见光谱；(7)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的圆二色光谱的测定，测定条件为狭缝宽度1nm，扫描波长范围为190～250nm，扫描速率为50nm·min‑1，响应时间为2s，再向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中加入0.01mol/L的游离色氨酸，达到摩尔比为高铁肌红蛋白：游离色氨酸＝1：1，分别测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白的圆二色光谱；二、激光诱导不同形态的肌红蛋白，包括的步骤：(1)激光还原高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白：在激光照射肌红蛋白溶液前，在室温20℃下，先通氮气以除去溶液中的溶氧，在室温20℃下，激光照射高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白，所用的激发光光源是Nd:YAG调Q激光器，探测光光源是450W氙灯，光谱采集时间范围为1000ns，波长范围为250‑800nm，通过L900软件将动力学吸收光谱转化为瞬态吸收光谱和动力学衰减曲线；(2)加入游离色氨酸后，激光还原向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白：在高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中加入0.01mol/L的游离色氨酸，达到摩尔比为高铁肌红蛋白：游离色氨酸＝1：1，激光照射肌红蛋白溶液前，在室温20℃下，激光照射高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白，在室温20℃下，先通氮气以除去溶液中的溶氧，所用的激发光光源是Nd:YAG调Q激光器，探测光光源是450W氙灯，光谱采集时间范围为1000ns，波长范围为250‑800nm，并通过L900软件将动力学吸收光谱转化为瞬态吸收光谱和动力学衰减曲线。