[发明专利]一种165基因靶区域富集测序方法

摘要

根据TCGA、NCCN、FDA等的癌症基因组及药物数据，筛选入组基因165个。其中包含NCCN推荐检测基因、FDA已批准靶药和重要临床期药物相应靶基因、影响靶药用药效果的基因、影响化药敏感性及毒副作用的基因等。本发明通过探针捕获技术一次性富集165个基因的外显子区域，实现多基因多靶点并行深度高通量测序，可同时检测基因的多种变异类型(如点突变，缺失，插入，融合，拷贝数扩增)，在检测的深度和准确度上均优于现有的技术。

主权项

一种用于165基因靶区域富集方法，其特征在于，包括如下步骤：提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ul ddH2O中，进行文库构建。提取5个不同样本血浆中的游离DNA，将DNA定量后分别溶解在50ul ddH2O中，进行文库构建。1.1准备末端修复所需试剂，10×KAPA End Repair Buffer，KAPA End Repair Enzyme Mix置于冰上溶解，5个样本DNA分别按照以下体系进行末端修复。将混合液上下吹打混匀后，置于20℃孵育30min。AMPure XP磁珠纯化2.1.让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；2.2.在1.5ml新管中加入1.7倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和修复后的5个DNA样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；2.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3‑5min至溶液变澄清；2.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；2.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；2.6.重复步骤5；2.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量。连接A尾。3.1将上述磁珠分别溶解在50ul A尾连接体系中，体系如下PCR级ddH2O                           42ul10×KAPA A‑Tailing Buffer            5ulKAPA A‑Tailing Enzyme                3ul将混合液上下吹打混匀后，置于30℃孵育30min。纯化A尾连接产物4.1向50ul连接产物中加入90ul融解的室温下的PEG/NaCl SPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠4.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3‑5min至溶液变澄清；4.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；4.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；4.5.重复步骤4.4；4.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量样本DNA连接接头5.1将上述磁珠分别溶解在47ul连接接头的体系中，体系如下PCR级水                       32ul5×KAPA Ligation Buffer       10ulKAPA T4DNA Ligase             5ul5.2将体系混匀后，每个样本中加入3ul含有不同Index的接头。上下吹混数次后，置于20℃孵育15min。纯化接头连接产物6.1向50ul连接产物中加入50ul融解的室温下的PEG/NaCl SPRI溶液，混匀混合物后室温静置15min以结合磁珠.6.2短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3‑5min至溶液变澄清；6.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；6.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；6.5.重复步骤5；6.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量6.7加入22ul ddH2O溶解DNA，混匀后室温5min，充分溶解，置于磁力架上静置2min，吸取22ul上清。捕获前扩增7.1扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Pre‑Capture LM‑PCR Master Mix置于冰上溶解，配置如下反应体系KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x)  25ulPre LM‑PCR Oligos 1&2,5μM*       5ul文库DNA                          20将上述混合液混匀并置于PCR仪中，执行如下程序反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。纯化捕获前前PCR产物8.1.在1.5ml新管中加入1.4倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和5个PCR产物，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；8.2.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3‑5min至溶液变澄清；8.3.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；8.4.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；8.5.重复步骤5；8.6.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量8.7.在磁力架上取下离心管加入52ul ddH2O，充分溶解DNA，室温下静置5min后，置于磁力架上，吸取50ul上清于新的离心管中。文库杂交9.1杂交前的准备，分别溶解SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE Index Oligo至终浓度为1000uM置于‑20℃.9.2准备杂交混合样本，将5个不同Index的样本定量，并且相同比例混合至1.25ug。9.3准备提高混合杂交的引物池，在冰上溶解1000uM的SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE Index Oligo，混合比例为50％的SeqCap HE Universal Oligo和50％的SeqCap HE Index Oligos，总引物量为2000pmol，具体实施如下表组分含量9.4准备杂交样本9.4.1取5ul COT Human DNA(1mg/ml)加入1.5ml离心管中9.4.2将1.25ug的混合文库加入到9.4.1的离心管中9.4.3将2000pmol的混合引物SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE Index Oligo加入到离心管中。具体实施如下将上述混合液置于具孔的离心管中并置于60℃真空浓缩，向管中加入7.5ul 2×Hybridization Buffer和3ul of Hybridization Component A，充分混匀，以最大转速离心10s后置于95℃孵育10min。以最大转速离心10s。向上述管中加入4.5ul的杂交探针SeqCap EZ probe pool，最终混合物如下表将上述混合物混匀后，置于47℃中，17h，热盖温度为57℃洗涤回收捕获产物洗涤回收前准备，将10×Wash Buffers(I,II,III and Stringent)和2.5×Bead Wash Buffer稀释成1×。提前将1×Stringent Wash Buffer、1×Wash Buffer I置于47℃中预热洗涤前磁珠的准备，吸取100ul磁珠在室温下放置30min，涡旋15s，置于磁力架上，静置5min后弃掉上清，加入200ul的1×Bead Wash Buffer，涡旋10s，置于磁力架上，弃掉上清。再加入200ul的1×Bead Wash Buffer，涡旋10s，置于磁力架上，弃掉上清。10.1磁珠结合DNA。将磁珠加入到15ul杂交文库中，上下吹打10次后置于47℃45min，每隔15min涡旋3s。10.2洗涤DNA结合磁珠，加入100ul预热到47℃的1×Wash Buffer I至15ul含有磁珠的文库中，转移到1.5ml EP管中，置于磁力架上，弃掉上清，加入200ul 47℃预热的1×Stringent Wash Buffer，上下弹打混匀，迅速置于47℃热浴上10.3重复10.2操作一次。10.4将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1X Wash Buffer I，涡旋2min。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1×Wash Buffer II，涡旋1min。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入200ul室温下的1×Wash Buffer III，涡旋30s。将离心管置于磁力架上，弃掉上清后，加入50ul ddH2O，置于‑20℃下保存。捕获后文库扩增11.1扩增前将引物用ddH2O溶解，并将Post‑LM‑PCR Master Mix置于冰上溶解，配置如下反应体系KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x)         25ulPost‑LM‑PCR Oligos 1&2,5μM*             5ul涡旋文库使磁珠混匀，取20ul加入到上述混合体系中，混匀并置于PCR仪中，执行如下程序反应结束后得到的即是捕获前PCR样本。纯化最终文库12.1.让AMPure XP bead在室温放置至少30min，充分混匀AMPure XP bead悬浮液；12.2.在1.5ml新管中加入1.8倍体积混匀的AMPure XP beads悬浮液和PCR样品，吹吸混匀10次以上，室温放置5min；12.3.短暂离心，将离心管放在磁力架上，静置大约3‑5min至溶液变澄清；12.4.在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠；12.5.在磁力架上，在每个管中分别加入200ul 80％乙醇，放置30s，弃乙醇；12.6.重复步骤5；12.7.在室温放置5min，使管中残留的乙醇完全蒸发；不能过分蒸干以防止降低产量，加入30ulddH2O,混匀后室温下放置2min，置于磁力架上，取28ul澄清液至新的EP管中。