[发明专利]一种高效提取沉积物中胞外DNA的方法

摘要

一种高效提取沉积物中胞外DNA的方法。该方法包括胞外DNA内标基因(CESA9)的构建，沉积物样品胞外DNA提取，以及内标基因的定量。本发明方法用于计算DNA提取效率的内标基因CESA9是拟南芥中一段纤维素合成酶基因，在所要提取DNA的环境样品中检测不到。本发明所述方法可以将环境样本中胞外DNA进行分离与纯化。通过紫外分光光度计检测，提取出的DNA的OD260/OD280可以达到1.57，OD260/OD230可以达到1.78，可以进行后续的分子操作，实用性较强。通过DNA的提取效率分析，该方法的沉积物中胞外DNA提取率可以达到57％，表明该方法可靠性程度较高。

主权项

一种高效提取沉积物中胞外DNA的方法，该方法的具体步骤为：第1：胞外DNA内标基因的构建；第1.1：胞外DNA内标基因克隆载体的构建；CESA9是拟南芥中一段纤维素合成酶基因，该基因片段作为计算胞外DNA提取的内标基因，将这段基因用PCR扩增之后进行切胶回收，取0.5‑4μl PCR与1μl pEASY‑T1克隆载体轻轻混合，室温反应5分钟，反应结束后，将离心管置于冰上；第1.2：胞外DNA内标基因的扩增加连接产物于50μl感受态细胞E.coli DH5α中，42℃水浴热激30秒，立即置于冰上2分钟；加入250μl平衡至室温的LB培养基，200rpm、37℃培养1小时；取8μl 500mM IPTG和40μl 20mg/ml X‑gal混合，均匀地涂布在准备好的平板上，37℃培养箱中放置30分钟。待IPTG和X‑gal被吸收后，取200μl菌液均匀地涂布在平板上，在37℃培养箱中过夜培养；挑选白色克隆接种于LB/AMP+或LB/Kan+的液体培养基中，200rpm、37℃培养6小时左右；用试剂盒小量提取质粒；第1.3：胞外DNA内标基因浓度的确定：对第1.2步提取的质粒用核酸浓度测定仪进行测定，确定内标基因浓度；第2：沉积物样品胞外DNA提取；第2.1：沉积物样品胞外DNA的分离；称取1g沉积物样品于10mL无菌离心管中，取10μg第1.2步提取的内标质粒加入到样品中，浓度为2.37×1013CFU/g沉积物；加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH2PO4溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，混合均匀，250rpm、25℃反应10分钟；然后在4℃条件下，10000×g离心10分钟，取上清液，过0.22μm PVDF滤膜，将滤液存放于冰上；向离心管剩余沉淀中再次加入4mL 0.12M、pH＝8.0的NaH2PO4溶液和0.2g PVPP(Polyvinyl pyrrolidone)，按上述过程操作，重复两次之后，将三次所得滤液混合；将滤液在4℃条件下，10000×g离心20分钟，上清液转移至新的无菌管中；第2.2：胞外DNA溶液的获得；向第2.1得到的液体中加入1体积的混合溶液，包括50mM Tris‑HCl、10mM EDTA和质量浓度为1％的CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)，pH＝8.0，65℃水浴30分钟，4℃条件下，5000×g离心10分钟，弃上清液；再向离心管中加入1体积的高盐度的TE缓冲液A重悬10分钟，所述TE缓冲液A中包括10mM Tris‑HCl、0.1mM EDTA和1M NaCl，pH＝8.0；加入0.6体积的冰异丙醇，在冰上反应1小时，4℃、10000×g离心10分钟；将沉淀再次重悬于1体积TE缓冲液B，所述TE缓冲液B中包括10mM Tris‑HCl、0.1mM EDTA，pH＝8.0；加入等体积的体积比为苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1的混合液，上下颠倒混匀进行抽提，在4℃下10000×g离心10分钟，取上层液体置于新的2mL无菌离心管中，重复此操作一次；用体积比为氯仿：异戊醇＝24:1的混合液再抽提新获得的上层液体一次，4℃下10000×g离心10分钟，取出上层液体，置于1.5mL的无菌离心管中；第2.3：粗DNA的纯化溶解；向第2.2步得到的液体中加入0.1倍体积的2M NaCl溶液和0.6倍体积的异丙醇，‑20℃时静置60分钟，10000×g离心15分钟，弃去上清液，用0.5mL体积比为70％的冷乙醇洗涤沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g离心2分钟，重复洗涤一次，弃去乙醇后将DNA在真空中进行干燥；用30μL的65℃预热的TE缓冲液溶解DNA，TE缓冲液为pH＝8.0的10mM Tris‑HCl和1mM EDTA混合溶液；第3：内标基因的定量；利用实时荧光定量PCR检测提取的DNA中所含内标基因CESA9的拷贝数量。