[发明专利]一种适于离体保存过程中微量兰科植物种子的灭菌及接种方法

摘要

本发明公开了一种兰科植物微量种子的灭菌及接种方法。结合组织培养技术的灭菌方法和DNA纯化柱等工具，设计了一套特别适用于果荚开裂、细小且微量的兰科植物种子的灭菌和接种方法。该技术克服了兰科植物种子在消毒过程中易出现的灭菌不充分、混种及消毒液残留的问题，能高效地进行微量的兰科植物种子的消毒和接种，有效降低污染率，具有实验器材易得、成本低廉、操作方便、接种效率高等优点。

主权项

一种兰科植物微量种子的灭菌及接种方法，将DNA纯化柱、200μl，1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20‑30min备用，用对折过的硫酸纸收集适量开裂的兰科种子，简单的去除果荚碎片杂质后，沿着折痕将种子倒入已灭菌的吸附柱中，然后把吸附柱放入收集管，并将吸附柱做好标记，在无菌条件下，向吸附柱中加入600μl的75％乙醇，倒立纯化柱1‑2次，之后200‑1000rpm离心20s，从加乙醇开始，直到完成离心，整个操作过程控制在28s‑35s；倒弃收集管中废液，向吸附柱中加入600μl无菌水，反复吸打无菌水使种子悬浮，充分漂洗种子，然后200‑1000rpm离心20s，洗脱75％乙醇溶液；倒弃收集管中废液，在无菌条件下向吸附柱中加入600μl的0.1‑0.2％氯化汞溶液灭菌4‑6min或2％次氯酸钠溶液消毒6‑10min，期间反复吸打溶液使种子悬浮充分灭菌，然后200‑1000rp离心20s；倒弃收集管中废液，再向吸附柱中加入600μl无菌水，反复吸打无菌水使种子悬浮，充分漂洗种子，然后200‑1000rpm离心20s，此操作重复3‑4次，使消毒液彻底洗脱；再向离心之后的吸附柱中添加600μl无菌水，改用量程为200μl的枪头反复吸打无菌水获得种子悬浊液；另吸取50‑300μl不等体积的种子悬浊液到培养基上，实现接种。